Pregled nekoliko tehnika mikroskopije super rezolucije
Za konvencionalnu svjetlosnu mikroskopiju, difrakcija svjetlosti ograničava rezoluciju slike na približno 250 nm. Danas tehnike super-rezolucije to mogu poboljšati za više od faktora 10. Ova tehnika se uglavnom postiže kroz tri metode: mikroskopija za lokalizaciju jedne molekule, uključujući fotosenzitivnu lokalizatorsku mikroskopiju (PALM) i mikroskopiju stohastičke optičke rekonstrukcije (STORM); strukturirana iluminacijska mikroskopija (SIM); i mikroskopija stimulirane emisije (STED). Kako odabrati tehnologiju super rezolucije je ono do čega je svima stalo. "Nažalost, ne postoje jednostavni principi za odlučivanje koju metodu koristiti", kaže Mathew Stracy, postdoktorski istraživač na Univerzitetu u Oksfordu, Velika Britanija. "Svako ima svoje prednosti i mane." Naučnici naravno također smišljaju kako odabrati pravu metodu za određeni projekat. "U kontekstu bioimaginga, ključni faktori koje treba uzeti u obzir uključuju: prostornu i vremensku rezoluciju, osjetljivost na fotooštećenje, kapacitet označavanja, debljinu uzorka i pozadinsku fluorescenciju ili autolognu fluorescenciju ćelije." Kako radi Različiti mikroskopi super rezolucije rade na različite načine. U slučaju PALM-a i OLUJE, samo mali dio fluorescentnih markera se pobuđuje ili fotoaktivira u datom trenutku, što omogućava njihovu neovisnu lokalizaciju s velikom preciznošću. Prolazak kroz ovaj proces sa svim fluorescentnim naljepnicama rezultira kompletnom slikom super rezolucije. Stefan Hell, jedan od dobitnika Nobelove nagrade za hemiju 2014. i direktor Instituta za biofizičku hemiju Maks Plank, rekao je: „Sistem PALM/STORM je relativno jednostavan za postavljanje, ali ga je teško primijeniti, jer fluorescentno grupa mora imati sposobnost fotoaktivacije. Ograničenja Nedostatak je u tome što moraju otkriti jedan fluorescentni molekul u kontekstu ćelije i manje su pouzdani od STED-a." STED koristi laserski impuls za pobuđivanje fluorofora i laser u obliku prstena za gašenje fluorofora, ostavljajući samo fluoroscenciju srednje veličine nanometara za super-rezoluciju. Skeniranjem cijelog uzorka dobiva se slika. "Prednost STED-a je u tome što je to tehnologija na dugme", objasnio je Hell. "Radi kao standardni konfokalni fluorescentni mikroskop." Takođe može da slika žive ćelije koristeći fluorofore kao što su zeleni ili žuti fluorescentni proteini i boje dobijene od rodamina. Parametrijsko poređenje Iako sve tehnike super-rezolucije nadmašuju konvencionalnu svjetlosnu mikroskopiju u smislu rezolucije, one se međusobno razlikuju. SIM otprilike udvostručuje rezoluciju na oko 100 nm. PALM i STORM mogu razriješiti ciljeve od 15 nm. Prema Hell-u, STED pruža prostornu rezoluciju od 30 nm u živim ćelijama i 15 nm u fiksnim ćelijama. Kada su u pitanju specifične primjene, moramo uzeti u obzir i omjer signal-šum. U nekim slučajevima, niža rezolucija, ali veći SNR može rezultirati boljom slikom od suprotnog (veća rezolucija, ali niži SNR). Brzina dobijanja slike je takođe veoma važna, posebno za žive ćelije. "Sve tehnike super-rezolucije su sporije od konvencionalnih tehnika fluorescentnog snimanja", rekao je Stracy. "PALM/STORM je najsporiji, potrebno mu je desetine hiljada kadrova da dobije jednu sliku, SIM treba desetine kadrova, a STED je tehnologija skeniranja, tako da brzina akvizicije zavisi od veličine vidnog polja." Pored živih ćelija ili fiksnih ćelija za snimanje, neki naučnici takođe žele da razumeju kako se objekti kreću. Stracy je zainteresiran za razumijevanje dinamike bioloških sistema u živim ćelijama, a ne samo za statične slike. On kombinuje PALM sa praćenjem jedne čestice kako bi analizirao dinamiku u živim ćelijama. Na taj način on može direktno pratiti molekule markera dok obavljaju svoje funkcije. Međutim, on smatra da SIM nije pogodan za proučavanje ovih dinamičkih procesa na molekularnom nivou, ali je zbog svoje velike brzine akvizicije posebno pogodan za promatranje dinamike većih struktura, kao što su cijeli hromozomi. Najnoviji rezultati U 2017. godini, Hell's tim je objavio MINFLUX mikroskop super rezolucije u Scienceu. Prema Hell-u, ova metoda super-rezolucije po prvi put postiže prostornu rezoluciju od 1 nm. Osim toga, može pratiti pojedinačne molekule u živim stanicama najmanje 100 puta brže od drugih metoda. Drugi naučnici su takođe pohvalno govorili o MINFLUX mikroskopu. "Nove aplikacije i pristupi se stalno razvijaju, ali dva napretka se ističu za mene", rekao je Shechtman. Jedan je MINFLUX. "Koristi genijalan pristup za postizanje vrlo preciznog molekularnog pozicioniranja." Što se tiče drugog uzbudljivog razvoja događaja, Shechtman je spomenuo WE Moernera i njegove kolege sa Univerziteta Stanford. Moerner je također bio dobitnik Nobelove nagrade za hemiju 2014. Jedan od pobjednika. Kako bi riješili ograničenje rezolucije slike uzrokovano anizotropnim rasipanjem fluorescentnih pojedinačnih molekula, naučnici su koristili različite polarizacije ekscitacije kako bi odredili orijentaciju i položaj molekula. Osim toga, razvile su osjetljive površine zjenica. Ove tehnike poboljšavaju sposobnost lokalizacije struktura. O fluorescentnim naljepnicama U mnogim aplikacijama super rezolucije, naljepnice su zaista važne. Postoje i neke kompanije koje nude srodne proizvode. Na primjer, njemački Miltenyi se udružio sa Abberiorom, kompanijom koju je osnovao Stefan Hell, kako bi pružio prilagođene usluge konjugacije antitijela za mikroskopske boje super rezolucije. Brojne druge kompanije također nude odgovarajuće markere. "Naši nano-pojačivači su vrlo mali, samo 1,5 kDa, i vrlo specifični," kaže Christoph Eckert, službenik za marketing u ChromoTek-u. Ovi proteini vezuju zelene i crvene fluorescentne proteine (GFP i RFP). Oni su izvedeni iz fragmenata antitijela alpake, poznatih kao VHH ili nanotijela, sa odličnim svojstvima vezivanja i stabilnim kvalitetom bez varijacija od serije do serije. Ovi markeri su pogodni za različite tehnike super-rezolucije, uključujući SIM, DLAN, STORM i STED. Ai-Hui Tang, docent na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Marylandu, i kolege koristili su ChromoTek-ov GFP-Booster i STORM za istraživanje širenja informacija u nervnom sistemu. Pronašli su molekularne nanoklastere, zvane nanokolone, u presinaptičkim i postsinaptičkim neuronima. Naučnici vjeruju da ova struktura pokazuje da centralni nervni sistem koristi jednostavne principe za održavanje i regulaciju sinaptičke efikasnosti. Različite verzije snimanja u super rezoluciji i sve veći broj metoda odvode naučnike još dublje u biološke misterije. Probijanjem granice difrakcije vidljive svjetlosti, biolozi mogu čak i "pomno pratiti" djelovanje ćelija.
