Primjena fluorescentne mikroskopije totalne unutrašnje refleksije
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), fluorescentni mikroskop totalne unutrašnje refleksije, kada svjetlost uđe u medij sa nižim indeksom prelamanja iz medija sa visokim indeksom prelamanja, ako je upadni ugao dovoljno velik, sva svjetlost se reflektira bez prelamanja, ali u Interfejs dva medija proizvodi prolazne talase koji mogu pobuditi fluorescenciju unutar 100 nm u blizini sučelja da bi se ostvarilo posmatranje površine objekta. Ekscitacijsko svjetlo se može poslati kroz iluminator konvencionalnog fluorescentnog mikroskopa ili posebnog iluminatora, a ugao upada lasera može se kontrolisati. Metoda trenutne ekscitacije polja se koristi da bi se spriječilo da ekscitacijsko svjetlo uđe u detektor. Ekscitacijsko svjetlo na međuprostoru između stakla i vode stvara potpunu unutrašnju stvar koja se ostvaruje refleksijom. Zbog eksponencijalnog slabljenja pobudnog svjetla, samo područje uzorka vrlo blizu ukupne površine refleksije će proizvesti refleksiju fluorescencije, što uvelike smanjuje interferenciju buke pozadinskog svjetla na cilj promatranja, tako da se ova tehnologija široko koristi u dinamičkom promatranju. supstanci površine ćelije.
Šematski dijagram fluorescentne mikroskopije totalne unutrašnje refleksije (TIRFM)
①Uzorak ②Evanescentni talasni opseg ③Pokrovno staklo ④Uranjanje u ulje ⑤Cilja ⑥Emisioni snop (signal) ⑦Pobudni snop
Da bi se postigla potpuna unutrašnja refleksija, potreban je veliki upadni ugao, na primer, upadni ugao na interfejsu staklo-voda je veći od 61 stepen. To se može postići prizmom, koja se naziva TIRFM zasnovan na prizmi, ili objektivnim objektivom sa velikim numeričkim otvorom, koji se naziva TIRFM tipa objektiva. Trenutni komercijalizovani fluorescentni mikroskopi sa totalnom unutrašnjom refleksijom uglavnom su tipa objektiva, sa velikom brzinom i visokom preciznošću.
Fluorescentna mikroskopija sa totalnom unutrašnjom refleksijom se široko koristi u nekim biološkim poljima jer može realizovati posmatranje fluorescencije u veoma tankom opsegu (manje od 100nm) na površini objekata. Kao što su sljedeće aplikacije:
Posmatranje slika površine ćelije: površinska struktura ćelijske membrane, kontakt površine ćelije, dinamika površine membrane/lokacija proteina.
Posmatranje i manipulacija jednog molekula: miozin, aktin i Cy3-obilježeni ATP.
Pokret površine ćelijske membrane: kao što je gutanje vezikula, izdisanje vezikula i egzokrina vezikula. the
Uočavanje fenomena varničenja kalcijuma u ćelijskoj membrani, praćenje jonskih kanala.
Istraživanje molekularnih motora: rotacijski motori, proteini citoskeleta, polimeri, G proteini, prstenasti proteini, nukleotidni motori.
Osim u polju biologije, ima dobre primjene iu području hemije za posmatranje hemijskih molekularnih struktura.
