Klasifikacija i rad mikroskopa za istraživanje ćelija
Mikroskop je primarni alat za posmatranje ćelija. Prema različitim izvorima svjetlosti, može se podijeliti u dvije kategorije: optički mikroskopi i elektronski mikroskopi. Prvi koristi vidljivo svjetlo (UV mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo) kao izvor svjetlosti, dok drugi koristi elektronske zrake kao izvor svjetlosti.
-,Optički mikroskop
(1) Običan optički mikroskop
Obični biološki mikroskopi se sastoje od tri dijela, i to: ① sistema osvjetljenja, uključujući izvor svjetlosti i kondenzator; ② Sistem optičkog uvećanja, koji se sastoji od objektiva i okulara, koji je glavno tijelo mikroskopa. Da bi se eliminisala sferna aberacija i hromatska aberacija, i okular i objektiv ③Mehanički uređaj, koji se koristi za fiksiranje materijala i olakšavanje posmatranja (slika 2-1).
Da li je slika mikroskopa jasna ne određuje se samo povećanjem, već se odnosi i na rezoluciju mikroskopa. Rezolucija se odnosi na sposobnost mikroskopa (ili ljudskog oka da bude udaljeno 25 cm od mete) da razlikuje najmanju udaljenost između objekata. Veličina rezolucije određena je talasnom dužinom i odnosom otvora svetlosti i indeksom prelamanja medija se izražava formulom:
U formuli: n=indeks prelamanja medija;=ugao otvora blende (ugao otvaranja uzorka prema otvoru sočiva objektiva), NA=otvor blende (numerički otvor blende). Ugao sočiva je uvijek manji od 180 stepeni, tako da maksimalna vrijednost sina/2 mora biti manja od 1.
Indeks prelamanja stakla koji se koristi za izradu optičkog sočiva je 1,65 do 1,78, a indeks prelamanja medija koji se koristi je bliži staklu, to bolje. Za suva sočiva objektiva, medij je zrak, a omjer blende objektiva je općenito 0.05 do 0,95; za uljne leće, kedrovo ulje se koristi kao medij, a omjer otvora objektiva može biti blizu 1,5.
Talasna dužina obične svjetlosti je {{0}}nm, tako da vrijednost rezolucije mikroskopa neće biti manja od 0.2μm, a rezolucija ljudskog oka je 0,2mm, tako da maksimalno uvećanje opšteg dizajna mikroskopa je obično 1000X.
(2) Fluorescentna mikroskopija
Neke supstance u ćelijama, kao što je hlorofil, mogu fluorescirati nakon zračenja ultraljubičastim zracima; neke supstance same po sebi ne mogu fluorescirati, ali ako su obojene fluorescentnim bojama ili fluorescentnim antitelima, mogu fluorescirati i kada su ozračene ultraljubičastim zracima, a fluorescentni mikroskop (sl. 2-2, 3, 4) je jedan od alata za kvalitativna i kvantitativna istraživanja takvih supstanci.
Fluorescencijski mikroskopi i obični mikroskopi imaju sljedeće razlike:
1. Metoda osvjetljenja je obično epi-iluminacija, odnosno izvor svjetlosti se projektuje na uzorak kroz sočivo objektiva (slika 2-3);
2. Izvor svjetlosti je ultraljubičasto svjetlo, valna dužina je kraća, a rezolucija je veća od one kod običnih mikroskopa;
3. Postoje dva specijalna filtera, onaj ispred izvora svjetlosti služi za filtriranje vidljive svjetlosti, a onaj između okulara i sočiva objektiva se koristi za filtriranje ultraljubičastog svjetla radi zaštite očiju.
(3) Laserski skenirajući konfokalni mikroskop
Laserski konfokalni skenirajući mikroskop (laserski konfokalni skenirajući mikroskop, slika 2-5, 6) koristi laser kao izvor svjetlosti za skeniranje i skenira sliku tačku po tačku, liniju po liniju, površinu po površinu, a skenirajući laser i fluorescentna kolekcija dijele sočivo objektiva, a fokus sočiva objektiva je Fokalna tačka skenirajućeg lasera je takođe i tačka objekta trenutnog snimanja. Budući da je talasna dužina laserskog snopa kratka, a snop vrlo tanak, konfokalni laserski skenirajući mikroskop ima višu rezoluciju, koja je oko 3 puta veća od običnog optičkog mikroskopa. Sistem je fokusiran jednom i skeniranje je ograničeno na jednu ravan uzorka. Kada je dubina fokusiranja različita, mogu se dobiti slike različitih nivoa dubine uzorka. Ove informacije o slici se pohranjuju u računar. Putem kompjuterske analize i simulacije može se prikazati trodimenzionalna struktura uzorka ćelije.
Konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija se može koristiti ne samo za posmatranje morfologije ćelije, već i za kvantitativnu analizu intracelularnih biohemijskih komponenti, statistiku optičke gustoće i merenje morfologije ćelije.
(4) Mikroskop tamnog polja
Mikroskop tamnog polja (mikroskop tamnog polja, slika 2-7) ima svjetlosni list u sredini kondenzatora, tako da svjetlo osvjetljenja ne ulazi direktno u ljudsko sočivo, već samo svjetlost koju reflektuje i difrakuje uzorak dozvoljeno je da uđe u sočivo objektiva, tako da je pozadina vidnog polja crna, ivice objekata su svetle. Koristeći ovaj mikroskop, čestice male veličine od 4-200nm se mogu vidjeti, a rezolucija može biti 50 puta veća od one kod običnih mikroskopa.
(5) Fazni kontrastni mikroskop
Fazokontrastni mikroskop (fazokontrastni mikroskop, slika 2-8, 9) P. Zernikea izumljen je 1932. godine i za njega je dobio Nobelovu nagradu za fiziku 1953. godine. Najveća karakteristika ovog mikroskopa je da može posmatrati neobojene uzorke i žive ćelije.
Osnovni princip faznokontrastne mikroskopije je da se razlika optičkog puta vidljive svjetlosti koja prolazi kroz uzorak promijeni u razliku amplitude, čime se poboljšava kontrast između različitih struktura i čine različite strukture jasno vidljivim. Nakon prolaska kroz uzorak, svjetlost se lomi, odstupa od prvobitne optičke putanje i kasni za 1/4λ (talasna dužina). Pojačajte, povećajte ili smanjite amplitudu, povećajte kontrast. U pogledu strukture, fazni kontrastni mikroskopi imaju dvije posebne karakteristike koje se razlikuju od običnih optičkih mikroskopa:
1. Prstenasta dijafragma se nalazi između izvora svjetlosti i kondenzatora, a njena funkcija je da svjetlost koja prolazi kroz kondenzator formira šuplji svjetlosni stožac i fokusira se na uzorak.
2. Fazna ploča (prstenasta fazna ploča) dodaje faznu ploču obloženu magnezijum fluoridom u sočivo objektiva, što može odgoditi fazu direktne ili difraktirane svjetlosti za 1/4λ. Postoje dvije vrste:
①A plus fazna ploča: Direktno svjetlo kasni za 1/4λ. Nakon što se spoje dvije grupe svjetlosnih valova, svjetlosni valovi se sabiraju, a amplituda se povećava. Struktura uzorka je svjetlija od okolnog medija, stvarajući svijetli kontrast (ili negativan kontrast).
② B plus fazna ploča: Difraktovana svjetlost kasni za 1/4λ. Nakon što se dva seta zraka spoje, svjetlosni valovi se oduzimaju, a amplituda postaje manja, formirajući tamni kontrast (ili pozitivan kontrast), a struktura je tamnija od okolnog medija.
