Poređenje konfokalnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa
Opšti optički mikroskop
Opšti biološki mikroskop se sastoji od tri dijela, i to: ① sistema osvjetljenja, uključujući izvor svjetlosti i kondenzator; ② Sistem optičkog pojačanja, koji se sastoji od objektiva i okulara, je glavni dio mikroskopa. Da bi se eliminisala sferna aberacija i hromatska aberacija, i okular i sočivo objektiva se sastoje od složenih grupa sočiva; (3) mehanički uređaj, koji se koristi za fiksiranje materijala i pogodno posmatranje.
Da li je slika mikroskopa jasna ili ne zavisi ne samo od povećanja, već i od rezolucije mikroskopa. Rezolucija se odnosi na sposobnost mikroskopa (ili mjesta gdje su ljudske oči udaljene 25 cm od mete) da razlikuje mali interval objekta zui. Rezolucija zavisi od talasne dužine svetlosti, odnosa otvora blende i indeksa prelamanja medija, koji se izražava formulom:
R{0}}.61λ /N．A. N．A．＝ｎsin /2
Gdje je: n= indeks prelamanja medija;=ugao ogledala (ugao otvaranja uzorka prema otvoru sočiva) i NA= numerički otvor. Ugao ogledala je uvek manji od 180? Stoga, zui vrijednost sina/2 mora biti manja od 1.
Indeks prelamanja stakla koji se koristi za izradu optičkih sočiva je 1,65~1,78, a indeks prelamanja medija koji se koristi je bliži onom stakla, to bolje. Za suvo sočivo objektiva, medij je zrak, a omjer otvora blende je općenito 0.05 ~ 0,95; Uljno sočivo koristi mirisni asfalt kao medij, a stopa otvaranja sočiva može biti blizu 1,5.
Talasna dužina obične svjetlosti je 400~700nm, tako da rezolucija mikroskopa nije manja od 0,2 μm, a rezolucija ljudskog oka je 0,2 mm, tako da je veliko uvećanje zui dizajnirano od strane generalni mikroskop je obično 1000X x.
Zašto vam je potreban konfokalni mikroskop?
1. Optički mikroskop je usavršen trudom i usavršavanjem naših velikih prethodnika. U stvari, obični mikroskopi nam mogu pružiti prekrasne mikroskopske slike jednostavno i brzo. Međutim, dogodio se događaj koji je donio revolucionarnu inovaciju u ovaj gotovo savršeni svijet mikroskopa, a to je izum "konfokalnog mikroskopa za lasersko skeniranje". Ovaj novi mikroskop karakteriše usvajanje optičkog sistema koji samo izdvaja informacije o slici na ravni u kojoj je fokus koncentrisan, i vraćanje dobijenih informacija u memoriju slike uz promenu fokusa, tako da živopisna slika sa potpunim trodimenzionalnim informacijama može se dobiti. Ovom metodom se jednostavno mogu dobiti informacije o obliku površine koje se ne mogu potvrditi običnim mikroskopima. Osim toga, za obične optičke mikroskope "poboljšanje rezolucije" i "produbljivanje dubine fokusa" su kontradiktorni uvjeti, posebno pri velikom uvećanju, ali za konfokalne mikroskope ovaj problem je riješen.
2. Prednosti konfokalnog optičkog sistema
Konfokalni optički sistem osvetljava tačku uzorka, a reflektovanu svetlost primaju i tačkasti receptori. Kada se uzorak postavi u fokusnu poziciju, skoro sva reflektovana svjetlost može doći do fotoreceptora, ali kada uzorak odstupi od fokusa, reflektirana svjetlost ne može doći do fotoreceptora. To znači da će u konfokalnom optičkom sistemu biti prikazana samo slika koja se poklapa sa fokusom, a fakula i beskorisno rasejano svetlo će biti zaštićeni.
3. Zašto koristiti laser?
U konfokalnom optičkom sistemu, uzorak je osvijetljen, a reflektovanu svjetlost prima i tačkasti fotoreceptor. Stoga, tačkasti izvor svjetlosti postaje neophodan. Laser pripada veoma tačkastim izvorima svetlosti. U većini slučajeva, izvor svjetlosti konfokalnog mikroskopa usvaja laserski izvor svjetlosti. Osim toga, karakteristike lasera, kao što su monokromatizam, usmjerenost i odličan oblik zraka, također su važni razlozi njegove široke upotrebe.
4. Posmatranje u realnom vremenu zasnovano na skeniranju velike brzine postaje moguće.
U laserskom skeniranju, akustični optički deflektor (AO primarni element) se koristi u horizontalnom smjeru, a Servo Galvano-ogledalo se koristi u vertikalnom smjeru. Budući da u akustičkoj optičkoj jedinici za otklon ne postoji dio mehaničke vibracije, može skenirati velikom brzinom, a moguće je promatrati u realnom vremenu na ekranu za praćenje. Velika brzina ove kamere je veoma važan projekat koji direktno utiče na brzinu fokusiranja i pronalaženja pozicije.
5. Odnos između pozicije fokusa i svjetline
U konfokalnom optičkom sistemu, kada je uzorak pravilno postavljen u fokusnu poziciju, svjetlina je velika, a prije i poslije njega, njegova svjetlina će naglo pasti (puna linija na slici 4). Ova osjetljiva selektivnost fokalne ravni je također princip mjerenja pravca visine konfokalnog mikroskopa i proširenja fokusne dubine. Nasuprot tome, obični optički mikroskop nema očiglednu promjenu svjetline prije i poslije pozicije fokusa (isprekidana linija na slici 4).
6. Visok kontrast i visoka rezolucija
U općem optičkom mikroskopu, reflektovana svjetlost koja odstupa od fokusa će interferirati i preklapaće se s dijelom za snimanje fokusa, čime se smanjuje kontrast slike. Nasuprot tome, u konfokalnom optičkom sistemu, rasejana svetlost izvan fokusa i raspršena svetlost unutar sočiva objektiva su skoro potpuno uklonjeni, tako da se može dobiti slika sa veoma visokim kontrastom. Osim toga, pošto svjetlost dvaput prolazi kroz sočivo objektiva, prvo se izoštrava slika tačke, a poboljšava se i rezolucija mikroskopa.
7. Funkcija optičke lokalizacije
U konfokalnom optičkom sistemu, reflektovana svjetlost dijela koji nije fokusna tačka je zaštićena mikroporama. Stoga se pri promatranju trodimenzionalnog uzorka formira slika poput one koja je nastala nakon rezanja uzorka fokusom (slika 5). Ovaj efekat se naziva optička lokalizacija, što spada u jednu od specijalnosti konfokalnog optičkog sistema.
8. Funkcija pomične memorije fokusa
Takozvana reflektovana svjetlost izvan fokusa je zaštićena mikroporama. S druge strane, može se smatrati da se sve tačke na slici formirane konfokalnim optičkim sistemom poklapaju sa fokusom. Stoga, ako se trodimenzionalni uzorak pomjeri duž Z-osi (optičke ose), slika će se akumulirati i pohraniti u memoriju, a zui će na kraju dobiti sliku formiranu podudarnošću cijelog uzorka i fokusa. . Na taj način, funkcija beskonačne dubine fokusa naziva se mobilna memorijska funkcija.
9. Funkcija mjerenja oblika površine
U funkciji pomicanja fokusa, oblik površine uzorka može se izmjeriti na beskontaktni način dodavanjem petlje za snimanje visine. Na osnovu ove funkcije moguće je snimiti koordinate Z-ose formirane velikom vrijednošću svjetline zui u svakom pikselu, a na osnovu te informacije mogu se dobiti informacije vezane za oblik površine uzorka.
10. Visoko precizna mjerna funkcija mikro veličine
Jedinica za prijem svjetlosti usvaja jednodimenzionalni CCD senzor slike, tako da na nju ne može utjecati nagib skeniranja uređaja za skeniranje, tako da se mjerenje visoke preciznosti može završiti. Osim toga, budući da se u isto vrijeme usvaja funkcija memorije pomicanja fokusa s podesivom dubinom fokusa, može se eliminisati greška mjerenja uzrokovana pomakom fokusa.
11. Trodimenzionalna analiza slike
Koristeći funkciju mjerenja oblika površine, trodimenzionalna slika površine uzorka može se lako napraviti. I ne samo to, već se mogu izvršiti i mnoge vrste analiza, kao što su: mjerenje hrapavosti površine, površina, zapremina, površina, kružnost, polumjer, dužina zui, perimetar, centar gravitacije, tomografska slika, FFT transformacija, linija mjerenje širine i tako dalje.
Laserski konfokalni skenirajući mikroskop može se koristiti ne samo za posmatranje morfologije ćelije, već i za kvantitativnu analizu biohemijskih komponenti u ćelijama, statistiku optičke gustoće i merenje morfologije ćelije.
