Trend razvoja konfokalne mikroskopije
Da bi se postigli bolji rezultati posmatranja na tehničkom nivou, konfokalna mikroskopija se fokusira na poboljšanje tehničkog nivoa sa aspekta poboljšanja rezolucije, smanjenja fototoksičnosti, povećanja brzine skeniranja, posmatranja debelih uzoraka i posmatranja in vivo. Trenutno je Z efikasan. Ono što promovira Zda za tehnologiju konfokalne mikroskopije je mikroskopija ultra visoke rezolucije, koja probija optičku granicu i omogućava istraživačima da dobiju finije ćelijske strukture, što doprinosi dubljem razumijevanju životnih aktivnosti istraživača. Sljedeći fokus istraživanja tehnologije konfokalne mikroskopije trebao bi se fokusirati na sljedeće točke:
1. Veća brzina skeniranja
Trenutno je brzina konfokalnog skeniranja ograničena mehaničkom strukturom opreme za skeniranje, a rezolucija se može žrtvovati samo da bi se postigla veća brzina skeniranja. Mnogi biološki procesi su toliko brzi da se ne mogu otkriti.
2. Savršenija tehnologija ultra visoke rezolucije
Trenutno, tehnologije ultra visoke rezolucije uključuju STORM, PALM, STED i SSIM, sa rezolucijama u rasponu od 20 do 200 nm, ali svaka tehnologija ima određene nedostatke, kao što su obrada uzorka, smjer Z-ose, fototoksičnost, itd. nije ni približno savršeno, i često je teško postići graničnu rezoluciju u stvarnom posmatranju.
3. Jača kompatibilnost
Tehnologija konfokalne mikroskopije uključuje različite metode ekscitacije, kao što je gore spomenuto posmatranje više fotona i svjetlosnog sloja, a koherentno anti-Stokesovo Ramanovo raspršivanje teoretski može dijeliti skup laserskih sistema. Mikroskop super rezolucije može biti uparen sa tehnologijom bijelog lasera. Međutim, zbog problema s patentima različitih kompanija, još uvijek postoji prostor za poboljšanje u smislu kompletnosti i kompatibilnosti, a trenutna oprema ne može u potpunosti iskoristiti tehničke prednosti aplikacije.
Principi konfokalne mikroskopije
Konfokalni mikroskop se sastoji od četiri dela: optičkog sistema mikroskopa, laserskog izvora svetlosti, skenera i sistema za detekciju i obradu. Kao izvor svjetlosti koristi laser sa dobrom koherentnošću. Usvaja konjugirani princip fokusiranja i uređaj na bazi tradicionalnog optičkog mikroskopa, i koristi kompjuterski set sistema za posmatranje, analizu i izlaz za obradu slike.
Laserski snop skeniranja prolazi kroz otvor na rešetki i formira tačkasti izvor svjetlosti, koji se reflektira na sočivo objektiva kroz razdjelnik zraka, fokusira se na uzorak i skenira. Nakon što se uzorak pobuđuje, emitovana fluorescencija se vraća u spektroskop i skuplja je do otvora za detekciju, a zatim se pretvara u električni signal pomoću fotomultiplikatorske cijevi i prenosi na kompjuter kako bi se prikazala jasna slika u žarišnoj ravni. Ekscitacijsko svjetlo je fokusirano na uzorak kroz otvor na rešetki, a fluorescencija je fokusirana na rupicu kroz sočivo objektiva. Ovaj proces formira dva fokusa, pa se naziva konfokalni mikroskop.
Obični biološki uzorci imaju složenu strukturu i određenu debljinu. Kada se posmatra običnim fluorescentnim mikroskopom, fluorescencija koju emituje uzorak se preklapa jedna s drugom, a rezolucija slike je znatno smanjena.
Konfokalna slika konfokalnog mikroskopa može efikasno potisnuti zalutalu svjetlost i svjetlost koja se ne mjeri izvan fokalne ravni od ulaska u detektor, ostvariti sliku u jednoj fokalnoj ravni i značajno poboljšati rezoluciju. Kada se pozornica ravnomjerno kreće u horizontalnom smjeru, može formirati jasnu jednoslojnu sliku, au vertikalnom smjeru može realizirati sloj-po-slojno skeniranje uzorka na različitim dubinama i dobiti trodimenzionalnu strukturu uzorka nakon trodimenzionalne rekonstrukcije, a to je takozvani "optički CT". Uzorak je označen fluorescentnom sondom, a zatim se posmatra konfokalnim mikroskopom. Ne samo da se mogu posmatrati različite fiksne ćelije i strukture tkiva, već se mogu kvalitativno i kvantitativno posmatrati i redovno meriti morfologija, struktura i joni živih ćelija.
