Razlika između fluorescentnog mikroskopa i normalnog mikroskopa
1. Pogledajte način osvjetljenja
Metoda osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa je općenito epi-tip, odnosno izvor svjetlosti se postavlja na ispitni uzorak kroz objektiv objektiva.
2. Pogledajte rezoluciju
Fluorescencijski mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti, s relativno kratkom valnom dužinom, ali je rezolucija veća od one kod običnih optičkih mikroskopa.
3, razlika u filteru
Fluorescencijski mikroskop koristi dva specijalna filtera, koji se koriste ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a koriste se između objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastog svjetla, koje može zaštititi ljudske oči.
Fluorescencijski mikroskop je također vrsta optičkog mikroskopa, uglavnom zato što je talasna dužina koju pobuđuje fluorescentni mikroskop kratka, pa to dovodi do razlike u strukturi i upotrebi fluorescentnog mikroskopa i običnog mikroskopa. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabog svjetla. , tako da je pod izuzetno slabom fluorescencijom i njegova sposobnost snimanja dobra. Zajedno s kontinuiranim poboljšanjem fluorescentne mikroskopije posljednjih godina, buka je također značajno smanjena. Stoga se sve više koristi fluorescentni mikroskopi.
Poznavanje dvofotonske fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip dvofotonske ekscitacije je: u slučaju velike gustine fotona, fluorescentne molekule mogu istovremeno apsorbirati dva dugovalna fotona i nakon vrlo kratkog života u tzv. ; efekat je isti kao korišćenje fotona sa talasnom dužinom upola manjom od duge talasne dužine da pobuđuje fluorescentni molekul. Dvofotonsko pobuđivanje zahtijeva veliku gustinu fotona, a kako ne bi oštetili ćelije, dvofotonska mikroskopija koristi impulsne lasere s blokadom moda visoke energije. Ovaj laser emituje lasersko svetlo sa visokom vršnom energijom i niskom prosečnom energijom, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom od 80 do 100 MHz. Kada se objektiv objektiva sa visokim numeričkim otvorom koristi za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustina fotona u fokusnoj tački objektivnog sočiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija se javlja samo u žarištu objektivne leće, tako da dvofotonskom mikroskopu nije potrebna konfokalna rupica, što poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije.
U općem fenomenu fluorescencije, zbog niske gustine fotona ekscitacijske svjetlosti, fluorescentni molekul može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitovati fluorescentni foton kroz tranziciju zračenja, koja se naziva jednofotonska fluorescencija. Za proces pobuđivanja fluorescencije sa laserom kao izvorom svjetlosti može doći do pojave dvofotonske ili čak višefotonske fluorescencije. U ovom trenutku, intenzitet ekscitacionog izvora svjetlosti koji se koristi je visok, a gustina fotona zadovoljava zahtjev da fluorescentni molekul apsorbuje dva fotona u isto vrijeme. U procesu korištenja općeg lasera kao izvora pobuđene svjetlosti, gustina fotona još uvijek nije dovoljna da proizvede dvofotonsku apsorpciju. Obično se koristi femtosekundni pulsni laser, a njegova trenutna snaga može doseći reda veličine megavata. Prema tome, talasna dužina dvofotonske fluorescencije je kraća od talasne dužine ekscitacionog svetla, što je ekvivalentno efektu koji proizvodi pobuđivanje talasnom dužinom polupobuđenja.
Dvofotonska fluorescentna mikroskopija ima mnoge prednosti:
1) Svjetlost dugih valova manje je pod utjecajem raspršivanja od svjetlosti kratkih valova i može lako prodrijeti u uzorak;
2) Fluorescentni molekuli izvan fokalne ravni nisu pobuđeni, tako da više pobudne svjetlosti može doći do fokalne ravni, tako da ekscitacijsko svjetlo može prodrijeti u dublje uzorke;
3) Blisko infracrveno svetlo dugih talasa je manje toksično za ćelije od svetlosti kratke talasne dužine;
4) Prilikom gledanja uzoraka dvofotonskom mikroskopijom, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost prisutni su samo u fokalnoj ravni. Stoga je dvofotonska mikroskopija prikladnija za gledanje debelih uzoraka nego jednofotonska mikroskopija, za gledanje živih ćelija ili za izvođenje eksperimenata fotoizbjeljivanja u fiksnoj tački.
Poznavanje konfokalne fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip konfokalne fluorescentne mikroskopije: korištenjem točkastog izvora svjetlosti za osvjetljavanje uzorka, na fokalnoj ravni se formira mala svjetlosna mrlja sa dobro definiranim obrisom. sastoji se od razdjelnika zraka. Razdjelnik zraka šalje fluorescenciju direktno na detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, odnosno rupica za osvjetljenje i rupica za detekciju. Geometrijske dimenzije njih su iste, oko 100-200 nm; u odnosu na svetlosnu tačku na fokalnoj ravni, ova dva su konjugirana, to jest, svetlosna tačka prolazi kroz niz sočiva, i konačno može biti fokusirana na otvor za osvetljenje i na otvor za detekciju u isto vreme. Na ovaj način, svjetlost iz žarišne ravni može biti koncentrisana unutar dometa detekcijske rupe, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod fokalne ravni blokirana iz otvora za detekciju i ne može se snimiti. Uzorak se skenira tačku po tačku laserom, a fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobija konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne tačke tačku po tačku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na kompjuter, te na kraju agregira na ekran u jasnu konfokalnu sliku cijele fokalne ravni. .
Svaka slika u fokalnoj ravni je zapravo optički poprečni presek uzorka, a ovaj optički presek uvek ima određenu debljinu, poznatu i kao optički presek. Budući da je intenzitet svjetlosti u žarišnoj tački mnogo veći od onog u nefokalnoj tački, a svjetlost u nefokalnoj ravni filtrira rupica, dubina polja konfokalnog sistema je približno nula, a skeniranje duž Z-osa može realizovati optičku tomografiju, formirajući Observe dvodimenzionalni optički presek na fokusiranoj tački uzorka. Kombinovanjem skeniranja u ravni XY (fokalna ravan) sa skeniranjem po Z-osi (optička osa), akumulacijom dvodimenzionalnih slika uzastopnih slojeva i obradom pomoću specijalnog kompjuterskog softvera, može se dobiti trodimenzionalna slika uzorka.
To jest, rupica za detekciju i rupica izvora svjetlosti su uvijek fokusirani na istu tačku, tako da fluorescencija pobuđena izvan ravni fokusiranja ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada konfokalnog lasera je da koristi laser kao izvor svjetlosti, a na osnovu tradicionalnog fluorescentnog mikroskopskog snimanja priključeni su uređaj za lasersko skeniranje i konjugirani uređaj za fokusiranje, a digitalna akvizicija i obrada slike sistem kontroliše kompjuter.
