Razlika između običnog mikroskopa i fluorescentnog mikroskopa
Fluorescencijski mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti za ozračivanje objekta koji se pregleda, tako da predmet emituje svjetlost, a zatim promatra predmet pod mikroskopom. Uglavnom se koristi za imunofluorescentne ćelije. Uglavnom se sastoji od izvora svjetlosti, sistema filterskih ploča i optičkog sistema za posmatranje fluorescentne slike uzorka kroz uvećanje okulara i objektiva. Pogledajmo razliku između ovog fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa.
1. U pogledu metoda osvjetljenja
Metoda osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa je općenito episkopska, odnosno izvor svjetlosti se projektuje na ispitni uzorak kroz objektiv objektiva.
2. U smislu rezolucije
Fluorescencijski mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti. Talasna dužina je relativno kratka, ali je rezolucija veća od one kod običnih optičkih mikroskopa.
3. Razlika u filteru
Fluorescencijski mikroskop koristi dva specijalna filtera, koji se koriste ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a koriste se između sočiva objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastog svjetla, koje može zaštititi ljudske oči.
Fluorescencijski mikroskop je također vrsta optičkog mikroskopa, uglavnom zato što je talasna dužina pobuđena fluorescentnim mikroskopom kratka, pa to dovodi do razlike u strukturi i upotrebi između fluorescentnog mikroskopa i običnog mikroskopa. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabe svjetlosti, tako da je pod izuzetno slabom fluorescencijom i njegova sposobnost snimanja dobra. Zajedno sa kontinuiranim poboljšanjem fluorescentnih mikroskopa posljednjih godina, buka je također uvelike smanjena. Zbog toga se koristi sve više fluorescentnih mikroskopa.
Poznavanje dvofotonske fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip dvofotonske pobude je: u slučaju velike gustine fotona, fluorescentne molekule mogu istovremeno apsorbirati dva fotona duge talasne dužine i emitovati foton kraće talasne dužine nakon kratkog perioda života u takozvanom pobuđenom stanju. . ; efekat je isti kao korišćenje fotona čija je talasna dužina polovina duge talasne dužine za pobuđivanje fluorescentnog molekula. Dvofotonska pobuda zahtijeva veliku gustinu fotona. Kako se ćelije ne bi oštetile, dvofotonska mikroskopija koristi impulsne lasere sa zaključavanjem moda visoke energije. Laser koji emituje ovaj laser ima visoku vršnu energiju i nisku prosječnu energiju, širina impulsa mu je samo 100 femtosekundi, a frekvencija može doseći 80 do 100 megaherca. Kada se koristi objektiv objektiva s velikim numeričkim otvorom za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustina fotona u žarišnoj tački objektivnog sočiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija se javlja samo u žarištu objektivne leće, tako da dvofotonskom mikroskopu nije potrebna konfokalna rupica, što poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije.
U općim fenomenima fluorescencije, zbog niske gustine fotona ekscitacijske svjetlosti, fluorescentni molekul može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitovati fluorescentni foton kroz radijacioni prelaz, što je jednofotonska fluorescencija. Za proces pobuđivanja fluorescencije pomoću lasera kao izvora svjetlosti može doći do dvofotonske ili čak višefotonske fluorescencije. U ovom trenutku, intenzitet ekscitacionog izvora svjetlosti koji se koristi je visok, a gustina fotona zadovoljava zahtjeve fluorescentnih molekula koji apsorbuju dva fotona u isto vrijeme. U procesu korištenja općeg lasera kao pobudnog izvora svjetlosti, gustina fotona još uvijek nije dovoljna da proizvede fenomen dvofotonske apsorpcije. Obično se koristi femtosekundni pulsni laser, a njegova trenutna snaga može doseći reda veličine megavata. Zbog toga je talasna dužina dvofotonske fluorescencije kraća od talasne dužine ekscitacione svetlosti, što je ekvivalentno efektu ekscitacije na polovini talasne dužine ekscitacije.
Dvofotonska fluorescentna mikroskopija ima mnoge prednosti:
1) Svjetlost dugih valova manje je pod utjecajem raspršivanja od svjetlosti kratkih valova i lako prodire u uzorak;
2) Fluorescentni molekuli izvan fokalne ravni nisu pobuđeni, tako da više pobudne svjetlosti može doći do fokalne ravni, tako da ekscitacijsko svjetlo može prodrijeti u dublje uzorke;
3) Blisko infracrveno svetlo dugih talasa je manje toksično za ćelije od svetlosti kratke talasne dužine;
4) Kada se koriste dvofotonski mikroskop za posmatranje uzoraka, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost se javljaju samo u fokalnoj ravni. Stoga je dvofotonska mikroskopija prikladnija od jednofotonske mikroskopije za posmatranje debelih uzoraka, za posmatranje živih ćelija ili za eksperimente fotoizbjeljivanja na licu mjesta.
Poznavanje konfokalne fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip konfokalne fluorescentne mikroskopije: za ozračivanje uzorka koristi se tačkasti izvor svjetlosti, a na fokalnoj ravni se formira dobro definirana mala svjetlosna mrlja. sastavljena od razdjelnika. Razdjelnik zraka šalje fluorescenciju direktno na detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, odnosno rupica za osvjetljenje i rupica za detekciju. Geometrijska veličina oba je ista, oko 100-200nm; u odnosu na svetlosnu tačku na fokalnoj ravni, ova dva su konjugirana, to jest, svetlosna tačka prolazi kroz niz sočiva, i konačno može biti fokusirana na otvor za osvetljenje i na otvor za detekciju u isto vreme. Na ovaj način, svjetlost iz žarišne ravni može se konvergirati u okviru otvora za detekciju, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod fokalne ravni blokirana izvan otvora za detekciju i ne može se snimiti. Laser skenira uzorak tačku po tačku, a fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke tačku po tačku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na kompjuter, i na kraju agregira u jasnu konfokalna slika cijele fokalne ravni na ekranu.
Svaka slika u fokalnoj ravni je zapravo optički poprečni presjek uzorka. Ovaj optički poprečni presek uvek ima određenu debljinu, poznatu i kao optički tanak presek. Budući da je intenzitet svjetlosti u žarišnoj tački mnogo veći od intenziteta u nefokusnoj tački, a svjetlost u nefokalnoj ravni filtrira rupicu, dubina polja konfokalnog sistema je približno nula, a skeniranje duž Z -os može realizovati optičku tomografiju, formirajući Posmatrajte dvodimenzionalni optički presek na fokusiranoj tački uzorka. Kombinujući skeniranje u ravni XY (fokalna ravan) sa skeniranjem po Z-osi (optička osa), trodimenzionalna slika uzorka se može dobiti akumuliranjem dvodimenzionalnih slika kontinuiranih slojeva i obraditi posebnim kompjuterskim softverom.
To jest, rupica za detekciju i rupica izvora svjetlosti su uvijek fokusirani na istu tačku, tako da fluorescencija pobuđena izvan fokalne ravni ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserskog konfokalnog je da koristi laser kao izvor svjetlosti, a na osnovu tradicionalnog fluorescentnog mikroskopskog snimanja, dodaje uređaj za lasersko skeniranje i konjugirani uređaj za fokusiranje, te je sistem za dobijanje digitalne slike i obrada putem kompjuterske kontrole.
