Razlike i karakteristike između fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa
Fluorescencijski mikroskop se razlikuje od običnog optičkog mikroskopa. Ne posmatra uzorak kroz osvetljenje običnog izvora svetlosti. Umjesto toga, koristi svjetlost određene valne dužine (obično ultraljubičasto svjetlo, plavo-ljubičasto svjetlo) da pobuđuje fluorescentni materijal u uzorku pod mikroskopom, uzrokujući da emituje fluorescenciju. Stoga, izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne služi kao direktno osvjetljenje, već kao izvor energije koji pobuđuje unutrašnji fluorescentni materijal uzorka. Razlog zbog kojeg možemo promatrati uzorak nije osvjetljenje izvora svjetlosti, već fenomen fluorescencije uzrokovan fluorescentnim materijalom u uzorku koji apsorbira pobuđenu svjetlosnu energiju. Vidi se da je glavna karakteristika fluorescentnog mikroskopa to što njegov izvor svjetlosti može isporučiti veliku količinu ekscitacijske svjetlosti u određenom opsegu talasnih dužina, tako da fluorescentne supstance u uzorku koji se ispituju mogu dobiti potreban intenzitet ekscitacione svetlosti. Istovremeno, fluorescentni mikroskopi moraju imati odgovarajuće sisteme filtera. Fluorescentna mikroskopija je suštinski alat za naprednu fluorescentnu histohemiju. Sastoji se od izvora svjetlosti ultra visokog pritiska, sistema filtera (uključujući filterske ploče za pobuđivanje i potiskivanje), optičkog sistema i sistema za fotografisanje. Koristi svjetlost određene valne dužine da potakne uzorak da emituje fluorescenciju.
1. Načini pobuđivanja fluorescencije: Prema opsegu talasnih dužina svetlosti, ona se deli na dva tipa: UV ekscitacioni metod (koristeći metodu ultraljubičastog osvetljenja) i BV metod ekscitacije (koristeći plavo-ljubičasto svetlo). Metoda UV ekscitacije koristi skoro ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm za pobuđivanje. U ovoj metodi nema vidljive ekscitacijske svjetlosti, tako da uočena fluorescencija pokazuje inherentnu fluorescenciju boje, što olakšava razlikovanje specifične fluorescencije na uzorku od autofluorescencije pozadinskog tkiva.
2. BV metoda ekscitacije: ekscitacija od ultraljubičastog do plavog svjetla sa centrom na 404nm i 434nm. Ova metoda koristi plavo svjetlo za osvjetljavanje uzorka, tako da granični filter sistema za posmatranje fluorescencije mora koristiti filter koji može u potpunosti blokirati plavo svjetlo i u potpunosti proći potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentne boje koje se koriste u metodama fluorescentnih antitijela. Maksimalna talasna dužina apsorpcije ekscitacione svetlosti i maksimalna talasna dužina emisije fluorescencije su relativno blizu, tako da filter koji se koristi u BV metodi ekscitacije mora da koristi oštar filter za odsecanje. Ova metoda može koristiti plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je efikasnost apsorpcije fluorescentnih pigmenata veća i mogu se dobiti svjetlije slike. Nedostatak je što se fluorescencija ispod 500nm ne može vidjeti, dok fluorescencija iznad 500nm čini da cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih antitijela, specifičnost fluorescentne boje uglavnom se procjenjuje po njenoj jedinstvenoj boji. Stoga, kada se govori o suptilnoj specifičnosti, gore navedeni nedostaci metode BV ekscitacije često imaju veliki uticaj.
