Primjena i korištenje principa fluorescentnog mikroskopa
(1) Princip i strukturne karakteristike fluorescentnog mikroskopa: fluorescentni mikroskop koristi tačkasti izvor svetlosti sa visokom svetlosnom efikasnošću da emituje svetlost određene talasne dužine (kao što je ultraljubičasto svetlo 3650 in ili ljubičasto plavo svetlo 4200 in) kroz sistem filtera kao pobudna svjetlost koja pobuđuje uzorak. Nakon što fluorescentna supstanca iznutra emituje fluorescenciju različitih boja, ona se posmatra kroz uvećanje objektiva i okulara. Na taj način, pod jakom kontrastnom pozadinom, čak i ako je fluorescencija vrlo slaba, lako se prepoznaje i ima visoku osjetljivost. Uglavnom se koristi za istraživanje strukture i funkcije ćelije i hemijskog sastava. Osnovna struktura fluorescentnog mikroskopa sastoji se od običnog optičkog mikroskopa plus neke dodatne opreme (kao što je fluorescentni izvor svjetlosti, ekscitacijski filter, dvobojni razdjelnik zraka i filter za blokiranje, itd.). Fluorescentni izvor svjetlosti - općenito koristite živinu lampu ultra visokog pritiska (50-200W), koja može emitovati svjetlost različitih talasnih dužina, ali svaka fluorescentna supstanca ima talasnu dužinu pobuđivanja koja proizvodi najjaču fluorescenciju, tako da je filter ekscitacije (Općenito, postoje ultraljubičasti, ljubičasti, plavi i zeleni ekscitacioni filteri), koji dozvoljavaju samo ekscitacionoj svetlosti određene talasne dužine da prođe i ozrači uzorak, dok apsorbuje drugu svetlost. Nakon što je svaka supstanca ozračena ekscitacijskom svjetlošću, emituje vidljivu fluorescenciju sa većom valnom dužinom od talasne dužine zračenja za vrlo kratko vrijeme. Fluorescencija je specifična i generalno slabija od ekscitacijske svjetlosti. Da bi se uočila specifična fluorescencija, potreban je filter za blokiranje (ili potiskivanje) iza objektiva. Ima dvije funkcije: jedna je da apsorbira i blokira ekscitacijsko svjetlo od ulaska u okular, kako ne bi poremetilo fluorescenciju i oštetilo oči; drugi je odabrati i pustiti da određena fluorescencija prođe, pokazujući određenu fluorescentnu boju. Dva filtera se moraju koristiti zajedno.
Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa u smislu njihovih optičkih putanja:
1. Transmisioni fluorescentni mikroskop: Ekscitacijski izvor svjetlosti prolazi kroz materijal uzorka kroz kondenzatorsko sočivo da pobuđuje fluorescenciju. Obično se koristi kolektor tamnog polja, a obični kolektor se također može koristiti za podešavanje ogledala tako da se pobudna svjetlost preusmjeri i zaobiđe na uzorak. Ovo je stariji fluorescentni mikroskop. Prednost je što je fluorescencija jaka pri malom uvećanju, ali nedostatak je što se fluorescencija smanjuje sa povećanjem povećanja. Stoga je bolje promatrati veće materijale uzoraka.
2. Epifluorescentni mikroskop je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Razlika je u tome što ekscitacijsko svjetlo pada sa sočiva objektiva na površinu uzorka, odnosno, isto sočivo objektiva se koristi kao kondenzator osvjetljenja i objektiv objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik snopa treba dodati u putanju svjetlosti, koja je 45 stepeni udaljena od laganog uranijuma. Ekscitacijsko svjetlo se reflektira u sočivo objektiva i sakuplja na uzorku. Fluorescencija koju generira uzorak i pobuđujuća svjetlost reflektirana od površine sočiva objektiva i površine pokrovnog stakla ulaze u sočivo objektiva u isto vrijeme i vraćaju se na dvobojni razdjelnik zraka kako bi pobudno svjetlo bilo odvojeno od fluorescencije , preostala pobudna svjetlost se apsorbira blokirajućim filterima. Kao što je prelazak na kombinaciju različitih filtera pobuđivanja/dvobojnog razdjelnika zraka/filtera za blokiranje, može zadovoljiti potrebe različitih fluorescentnih reakcijskih proizvoda. Prednost ove vrste fluorescentnog mikroskopa je u tome što je osvjetljenje vidnog polja ujednačeno, slika jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
(2) Kako koristiti fluorescentni mikroskop.
1. Uključite izvor svjetlosti i živina lampa ultra visokog pritiska treba da se zagreje nekoliko minuta da bi došla do najsjajnije tačke.
2. Transmisioni fluorescentni mikroskop treba da instalira potreban filter za pobuđivanje između izvora svetlosti i kondenzatora, i da instalira odgovarajući filter za blokiranje iza objektiva. Epifluorescentni mikroskopi moraju da umetnu potrebni filter za pobuđivanje/dvobojni razdjelnik zraka/filter za blokiranje u utore na putu svjetlosti.
3. Posmatrajte sočivom sa malim uvećanjem i podesite centar izvora svetlosti tako da se nalazi u centru cele tačke osvetljenja prema uređaju za podešavanje različitih modela fluorescentnih mikroskopa.
4. Stavite uzorak i posmatrajte nakon fokusiranja. Treba obratiti pažnju prilikom upotrebe: ne posmatrajte direktno krajnjim filterom, kako ne biste oštetili oči; pri promatranju uzoraka uljnim sočivom mora se koristiti posebna uljna leća bez fluorescencije; nakon što se živina lampa visokog pritiska isključi, ne može se odmah ponovo uključiti, potrebno je testirati. Može se ponovo pokrenuti nakon 5 minuta, inače će biti nestabilan i utjecati na vijek trajanja živine lampe.
(3) Posmatrajte ćelije obojene 0.01 posto akridin narandžastom fluorescentnom bojom pod fluorescentnim mikroskopom na platformi za učenje sa filterom plavo-ljubičastog svjetla. Jezgro i citoplazma su pobuđeni da proizvode dvije različite boje fluorescencije (tamno zelenu i narandžasto-crvenu).
