Kako se morfologija mikrobnih ćelija posmatra pod mikroskopom?
Mikroskopi su izmišljeni da vide nasmejane predmete koji se ne mogu videti golim okom. Mikroorganizmi su vrlo mali, pa ih je potrebno uvećati i posmatrati uz pomoć mikroskopa. Osim toga, postoji mnogo vrsta mikroorganizama, tako da u osnovi većina optičkih mikroskopa može promatrati mikroorganizme. Sljedeće pitanje je koji tip mikroskopa treba koristiti za posmatranje i analizu koje vrste mikroorganizama. Uobičajeni mikroskopi koji se mogu koristiti za promatranje mikrobne morfologije uključuju biološke mikroskope, fazno kontrastne mikroskope, invertne mikroskope, fluorescentne mikroskope, konfokalne mikroskope itd.
U nastavku su opisani različiti mikroskopi koji se koriste za posmatranje mikroorganizama:
1. Običan optički mikroskop koristi prirodno svjetlo ili svjetlo kao izvor svjetlosti, a njegova talasna dužina je oko 0.4 μm. Rezolucija mikroskopa je polovina talasne dužine, odnosno 0.2 μm, a najmanja slika vidljiva golim okom je 0.2 mm. Stoga, korištenje uljnog (imerzionog) ogledala za uvećanje 1000 puta može povećati čestice od 0,2 μm u 0,2 mm vidljive golim okom. Obični optički mikroskopi mogu se koristiti za promatranje bakterija, aktinomiceta i gljivica.
2. Mikroskopija tamnog polja se obično koristi za posmatranje neobaljene mikrobne morfologije i kretanja. Nakon što se kondenzator tamnog polja ugradi u običan mikroskop, svjetlost ne može prodrijeti direktno iz sredine, a vidno polje je tamno. Kada uzorak primi koso svjetlo s ruba kondenzatora, može se raspršiti, tako da se svijetli mikroorganizmi kao što su bakterije ili spirohete mogu uočiti u tamnoj pozadini polja.
3. Fazni kontrastni mikroskop Fazni kontrastni mikroskop koristi svjetlosni efekat ploče s faznom razlikom da promijeni svjetlosnu fazu i amplitudu direktne svjetlosti i pretvori razliku svjetlosne faze u razliku intenziteta svjetlosti. Pod fazno-kontrastnim mikroskopom, kada svjetlost prolazi kroz neobojen uzorak, razlika u svjetlosnoj fazi je uzrokovana nedosljednošću gustine različitih dijelova uzorka, a može se uočiti morfologija, unutrašnja struktura i način kretanja mikroorganizama.
4. Fluorescencijski mikroskop Fluorescencijski mikroskop je u osnovi isti kao i obični optički mikroskop, glavna razlika je izvor svjetlosti, filter i kondenzator. Trenutno većina njih koristi epi-svjetlosne uređaje, a kao izvori svjetlosti najčešće se koriste živine lampe visokog pritiska, koje mogu emitovati ultraljubičasto ili plavo-ljubičasto svjetlo. Postoje dvije vrste filtera: filter pobude i filter apsorpcije. Osim općih kondenzatora svijetlog polja, kondenzatori tamnog polja se također mogu koristiti u fluorescentnim mikroskopima koji koriste plavo svjetlo kako bi se poboljšao kontrast između fluorescencije i pozadine. Ova metoda je primjenjiva na detekciju ili identifikaciju bakterija obojenih fluorescentnim pigmentima ili u kombinaciji s fluorescentnim antitijelima.
5. Elektronski mikroskopi koriste protok elektrona kao izvor svjetlosti, a talasna dužina je desetine hiljada puta različita od vidljive svjetlosti, što uvelike poboljšava rezoluciju. Takođe koristi magnetnu zavojnicu kao sistem optičkog pojačanja, a uvećanje može doseći desetine hiljada ili stotine hiljada puta. Često se koristi za promatranje virusnih čestica i ultrastrukture bakterija.
Posmatranje neobojenih mikrobnih uzoraka:
Neobojeni uzorci se općenito mogu koristiti za promatranje morfologije, snage i kretanja bakterija. Bakterije su bezbojne i prozirne kada nisu obojene, a posmatraju se pod mikroskopom uglavnom po razlici između indeksa prelamanja bakterije i okolnog okruženja. Bakterije sa flagelama se kreću snažno, dok bakterije bez flagela pokazuju nepravilno Brownovo kretanje. Vibilne bakterije kao što su Treponema pallidum, Leptospira i Campylobacter imaju karakteristične oblike i obrasce kretanja, koji su od dijagnostičkog značaja. Najčešće korištene metode su metoda pada tlaka, metoda visećeg pada i kapilarna metoda.
1. Nanesite vazelin oko konkavne rupe čistog konkavnog stakla metodom viseće kapi, koristite petlju za inokulaciju da uzmite prsten bakterijske suspenzije i stavite ga u sredinu pokrivnog stakla, a zatim poravnajte konkavnu rupu na konkavnom staklu sa kap u sredini pokrovnog stakla i pokrijte ga, zatim ga brzo okrenite, lagano pritisnite pokrovno staklo kako bi se čvrsto zalijepilo za vazelin na rubu konkavne rupe i promatrajte pod mikroskopom s velikim uvećanjem (ili tamno polje).
2. Uzmite prsten bakterijske suspenzije sa petljom za inokulaciju i stavite ga u središte čistog staklenog predmetnog stakala metodom pada pritiska, i nježno pokrijte bakterijsku suspenziju pokrovnim staklom, vodeći računa da izbjegnete mjehuriće i prelijevanje bakterijske suspenzije . Nakon što mirujete nekoliko sekundi, promatrajte pod mikroskopom velike snage u svijetlom polju (ili tamnom polju).
3. Kapilarna metoda se uglavnom koristi za ispitivanje kinetike anaerobnih bakterija. Obično odaberite dužinu od 60~70mm. Nakon sifoniranja suspenzije anaerobnih bakterija kroz kapilaru sa otvorom od 0.5-1.0 mm, zatvorite dva kraja kapilare plamenom. Kapilara je fiksirana na staklo plastičnim papirom i posmatrana pod sočivom velike snage u tamnom polju.
Posmatranje obojenih mikrobnih uzoraka mikroskopom:
Nakon što je bakterijski uzorak obojen, zbog oštrog kontrasta u boji između bakterije i okolnog okruženja, morfološke karakteristike bakterije (kao što su veličina, oblik, raspored itd.) bakterija i neke posebne strukture (npr. kao kapsule, flagele, spore, itd.) mogu se jasno uočiti pod običnim optičkim mikroskopom, a bakterije se mogu klasificirati i identificirati prema reaktivnosti bojenja.
(1) Opći postupak bakterijskog bojenja Opći postupak bakterijskog bojenja je: razmazivanje (sušenje)—fiksacija—bojenje.
1. Razmaz Priprema krvi, sekreta, izlučevina, punkcijske tekućine i tečne kulture, te direktni razmazi tankog filma na stakalcima; obdukcije ili inficiranih životinjskih tkiva, namažite leziju pamučnim štapićem za uzorkovanje. Za pripremu kolonija bakterija ili travnjaka na čvrstoj podlozi, prvo upotrijebite petlju za inokulaciju da uzmete prsten normalne fiziološke otopine i stavite ga u središte staklenog stakalca, zatim koristite sterilnu inokulacijsku petlju da uzmete malu količinu kulture i sameljete ravnomjerno u fiziološkom rastvoru, rasporedite na 1 cm2 premazanu površinu i ostavite da se prirodno osuši na sobnoj temperaturi ili da se polako osuši na daljinu.
2. Svrha fiksacije je ubijanje bakterija, koagulacija bakterijskog proteina i strukture i olakšavanje bojenja; podstiču bakterije da prianjaju na stakalcu kako bi se izbjeglo ispiranje vodom tokom pranja; mijenjaju propusnost bakterija za boje, što je korisno za bojenje intracelularnih struktura bakterija. Obično se fiksira zagrijavanjem plamenom, a osušeni razmaz se brzo 3 puta propušta kroz plamen. Bolje je da ne opečete kožu na stražnjoj strani šake kada dodirne tobogan.
3. Bojenje Prema različitim svrhama inspekcije, odaberite različite metode bojenja za bojenje. Prilikom bojenja dodajte otopinu boje kap po kap kako biste povećali pokrivenost.
4. Bojica Svaka supstanca koja može povećati afinitet između boje i obojenog predmeta, fiksirati boju na obojeni predmet i uzrokovati promjenu propusnosti ćelijske membrane naziva se jedka. Obično se koriste stipsa, taninska kiselina, soli metala i jod, itd., a zagrijavanje se također koristi za promoviranje bojenja. Bojalice se mogu koristiti između primarnog bojenja i kontraboja, a mogu se koristiti i nakon fiksiranja ili sadržane u fiksativu i bojenju.
5. Dekolorizacija Bilo koji hemijski agens koji može ukloniti boju obojenog predmeta naziva se dekolorizator. Etanol, aceton, itd. se obično koriste kao dekolorizatori. Sredstvo za dekolorizaciju može otkriti stupanj stabilnosti kombinacije bakterija i boja, koje se mogu koristiti za diferencijalno bojenje.
6. Protivbojno bojenje Bakterije ili njihove strukture koje su obezbojene često se protivboje rastvorom protiv bojenja radi lakšeg posmatranja. Boja otopine za protivbojanje se razlikuje od boje otopine primarne boje kako bi se stvorio oštar kontrast. Protivbojenje ne bi trebalo da bude prejako, kako ne bi prikrilo boju početnog bojenja.
