Poboljšane prednosti laserskog skeniranja multifotonske mikroskopije
Laserski skenirajući višefotonski mikroskop je veliko poboljšanje u optičkoj mikroskopiji, uglavnom u mogućnosti posmatranja duboke strukture živih i fiksnih ćelija i tkiva, te dobijanja jasnih i oštrih višeslojnih Z-ravninskih struktura, odnosno optičkih rezova iz kojih se može se konstruisati trodimenzionalna čvrsta struktura uzorka. Konfokalna mikroskopija koristi laserski izvor svjetlosti koji se širi kako bi ispunio cijelu stražnju žarišnu ravan sočiva objektiva, a zatim prolazi kroz sistem sočiva objektiva kako bi konvergirao u vrlo male tačke na fokalnoj ravni uzorka. U zavisnosti od numeričkog otvora objektiva, veličina prečnika tačke svetle iluminacije je oko 0.25 ~ 0.8 μm, a dubina je oko 0.5 ~ 1.5 μm. Veličina konfokalne tačke određena je dizajnom mikroskopa, talasnom dužinom lasera, karakteristikama sočiva objektiva, postavkom stanja jedinice za skeniranje i prirodom uzorka. Terenski mikroskopi imaju veliki raspon osvjetljenja i dubinu osvjetljenja, dok konfokalni mikroskopi koncentrišu osvjetljenje na jednu fokusnu tačku na fokalnoj ravni. Najosnovnija prednost konfokalnog mikroskopa je mogućnost pravljenja finih optičkih preseka debelih fluorescentnih uzoraka (do 50 μm ili više), sa debljinom preseka od oko 0,5 do 1,5 μm. Niz slika optičkog preseka može se dobiti pomeranjem uzorka gore-dole pomoću koračnog motora mikroskopa Z-ose. Prikupljanje informacija o slici kontroliše se u prvoj ravni i ne ometa se signalima koji se emituju sa drugih lokacija na uzorku. Nakon uklanjanja efekata pozadinske fluorescencije i povećanja odnosa signal-šum, kontrast i rezolucija konfokalne slike su značajno poboljšani u odnosu na konvencionalne fluorescentne slike osvetljene poljem. U mnogim uzorcima, mnoge zamršene strukturne komponente se prepliću kako bi formirale složene sisteme, ali kada se dobije dovoljno optičkih preseka, možemo ih rekonstruisati u tri dimenzije koristeći softver. Ova eksperimentalna metoda se široko koristi u biološkim istraživanjima kako bi se razjasnili složeni strukturni i funkcionalni odnosi između stanica ili tkiva.
