Mikrobiološki mikroskop direktno brojanje
Eksperimentalni princip
Direktno brojanje pod mikroskopom pomoću hemocitometra je uobičajena metoda brojanja mikroba. Prednost ove metode je što je intuitivna i brza. Stavite odgovarajuće razrijeđenu suspenziju bakterija (ili suspenziju spora) u komoru za brojanje između stakalca i pokrivnog stakla hemocitometra i brojite pod mikroskopom. Pošto je zapremina komore za brojanje fiksna (0.1mm2), može se pretvoriti u ukupan broj mikroorganizama po jedinici zapremine prema broju mikroorganizama posmatranih pod mikroskopom. Budući da ova metoda broji zbir živih i mrtvih bakterija, naziva se i metoda ukupnog broja bakterija.
Hemocitometar je obično posebna staklena pločica na kojoj četiri utora formiraju tri platforme. Platforma u sredini podijeljena je na dvije polovine kratkim horizontalnim žlijebom. Na platformi sa svake strane je ugravirana mreža. Svaka mreža je podijeljena na devet velikih kvadrata. Veliki kvadrat u sredini je soba za brojanje. Mikroorganizmi se broje u komori za brojanje.
Skala sobe za brojanje općenito ima dvije specifikacije, jedna je da je veliki kvadrat podijeljen na 16 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 25 malih kvadrata (slika Ⅷ-2); drugi je veliki kvadrat Kvadrat je podijeljen na 25 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 16 malih kvadrata (slika Ⅷ-1, C). Ali bez obzira na vrstu ploče za brojanje, broj malih kvadrata u svakom velikom kvadratu je isti, odnosno 16×25=400 malih kvadrata.
Dužina stranice svakog velikog kvadrata je 1 mm, a površina svakog velikog kvadrata je 1 mm2. Nakon što je pokrovno staklo pokriveno, visina između kliznog stakla i pokrovnog stakla je 0.1 mm, tako da je zapremina komore za brojanje 0.1 mm3.
Prilikom brojanja, obično izbrojite ukupan broj bakterija u pet srednjih kvadrata, zatim dobijete prosječnu vrijednost svakog srednjeg kvadrata, a zatim pomnožite sa 16 ili 25 da biste dobili ukupan broj bakterija u velikom kvadratu, a zatim pretvorite u ukupan broj bakterija u 1 ml bakterijske otopine.
Laboratorijska oprema
Hemocitometar, mikroskop, pokrovno staklo, sterilna kapilara;
Eksperimentalni materijali
Suspenzija Saccharomyces cerevisiae
Eksperimentalni postupak (metoda direktnog brojanja mikroskopom)
1. razblaživanje
Pravilno razrijedite suspenziju Saccharomyces cerevisiae. Ako bakterijska otopina nije gusta, ne treba je razrjeđivati.
2. Mikroskopska soba za brojanje
Prije dodavanja uzoraka, izvršite mikroskopski pregled komore za brojanje ploče za brojanje. Ako ima prljavštine, potrebno je očistiti prije brojanja.
3. dodati uzorak
Čistu i suhu ploču hemocitometra prekrijte pokrovnim staklom, a zatim sterilnom kapaljkom s uskim otvorom kapnite malu kap razrijeđenog rastvora Saccharomyces cerevisiae s ruba pokrivnog stakla (ne previše), tako da otopina bakterija je blizu otvora duž jaza. Kapilarna osmoza sama ulazi u komoru za brojanje, a opća komora za brojanje može se napuniti bakterijskom tekućinom. Pazite da nema mjehurića zraka.
4. broj mikroskopa
Nakon mirovanja od 5 minuta, postavite hemocitometar na podnožje mikroskopa, prvo koristite sočivo male snage da pronađete lokaciju komore za brojanje, a zatim pređite na sočivo velike snage za brojanje. Ako se utvrdi da je bakterijska otopina pregusta ili prerijetka prije brojanja, potrebno je ponovno podesiti razrjeđenje prije brojanja. Za generalno razrjeđivanje uzorka potrebno je oko
5-10 ćelija je pogodno. Svaka komora za brojanje bira bakterije u 5 srednjih mreža (opciono 4 ugla i centralne mreže) za brojanje. Bakterije na liniji mreže obično se broje samo na gornjoj i desnoj liniji. U slučaju pupanja kvasca, kada veličina tijela pupoljka dostigne polovinu matične stanice, izbrojite dvije bakterije. Izbrojite uzorak da biste izračunali sadržaj bakterija u uzorku iz vrijednosti izbrojanih u dvije komore za brojanje.
5. Čišćenje hemocitometra
Nakon upotrebe, isperite ploču za brojanje krvnih zrnaca na slavini mlazom vode, nemojte je prati tvrdim predmetima, a nakon pranja je osušite sami ili fenom. Mikroskopski pregled, posmatrajte da li u svakoj ćeliji ima zaostalih bakterija ili drugih sedimenata. Ako nije čist, mora se više puta prati dok ne bude čist.
