Učionica za mikroskopsko snimanje丨Primjena fluorescentne mikroskopije
Fluorescentna mikroskopija sa totalnom unutrašnjom refleksijom (TIRFM) je tehnika koja koristi evanescentni val generiran svjetlosnim snopom koji se širi između dva različita medija indeksa prelamanja za ispitivanje površine fluorescentno obilježenih živih stanica. U praksi, kada upadni laserski snop naiđe na interfejs između pokrovnog stakla i vodenog medija koji sadrži ćelije, on se reflektuje pod kritičnim uglom (totalna unutrašnja refleksija). Budući da energija evanescentnog vala opada eksponencijalno s rastojanjem od pokrovnog stakala, samo fluorofori unutar 10 nanometara od površine (između 10 i 200 nanometara) su pobuđeni evanescentnim valom, dok su fluorofori koji su udaljeniji uglavnom nepobuđeni. Pogođeno. Dakle, TIRFM rezultira visokim nivoima signala iz fluorofora koji se nalaze u blizini pokrovnog stakala, koji su postavljeni na veoma tamnoj pozadini, pružajući odličan omjer signala i šuma. Ekstremno ograničenje dubine ekscitacije idealno je za proučavanje pojedinačnih molekula ili sastava membrane i organela u adherentnim ćelijama u blizini površine pokrovnog stakala (vidi sliku 8(e)). Budući da je ekscitacija ograničena na tanke regije u blizini pokrovnog stakala, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost su također ograničeni na ove regije, što TIRFM čini jednom od najkorisnijih metoda za dugoročno posmatranje. Tehnika je postala temeljno sredstvo za proučavanje širokog spektra fenomena u ćelijskoj i molekularnoj biologiji.
Dekonvolucija je algoritam koji se primjenjuje na skup slika sa svim fokusom dobivenih duž optičke (Z) ose kako bi se poboljšao fotonski signal u hrpi slika za datu ravan slike ili više fokalnih ravnina. Mikroskopi moraju biti opremljeni motorizovanim pogonima za fokusiranje visoke preciznosti kako bi se garantovala akvizicija slike u precizno definisanim intervalima između fokalnih ravni uzorka. U tipičnoj primjeni (vidi Sliku 8(f)), proces dekonvolucije se koristi za uklanjanje zamućenja i uklanjanja svjetlosti van fokusa iz date fokalne ravni koristeći ekscitaciju i emisiju fluorescencije širokog polja. Najkompleksnija aplikacija je primjena procesa dekonvolucije na cijeli stog slika za generiranje projiciranih pogleda ili 3D modela. Skup slika širokog polja koji se koristi za dekonvoluciju bilježi teoretski maksimalni broj fotona koje emituje uzorak. Proces dekonvolucije redistribuira "zamućene" intenzitete fotona emitovanih iznad i ispod fokalne ravni nazad u prvobitnu ravan. Dakle, dekonvolucija koristi skoro sve dostupne intenzitete emisije i obezbeđuje optimalan budžet svetlosti, što ovu tehniku čini metodom izbora za uzorke koji su veoma osetljivi na svetlost.
Varijanta fenomena rezonantnog prijenosa energije na fluorescentnoj mikroskopiji, fluorescenciji ili Förster rezonantnom prijenosu energije (FRET) koristi se za dobivanje kvantitativnih vremenskih i prostornih informacija o vezivanju i interakciji proteina, lipida, enzima i nukleinskih kiselina u živim stanicama. FRET može koristiti tehnike konstantnog stanja ili vremenski razlučene tehnike, ali vremenski razlučeno FRET snimanje ima prednost preciznijeg mapiranja udaljenosti donor-akceptor. Standardni fluorescentni mikroskop širokog polja opremljen odgovarajućim filterima ekscitacije i emisije i osjetljivom kamerom može se koristiti za FRET snimanje. Biosenzori koji spajaju ekološki osjetljiv protein ili peptid između dva fluorescentna proteina primjenjiva na FRET trenutno se široko koriste u ćelijskoj biologiji. Ove sonde se lako snimaju pod fluorescentnom mikroskopijom širokog polja korištenjem senzibiliziranih emisionih FRET tehnika u kombinaciji sa raciometrijskom analizom. Osim toga, spektralna slika i linearno nemiješanje pomoću laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije mogu pomoći u praćenju FRET fenomena u biosenzorima i drugim aplikacijama fluorescentnih proteina.
Fluorescentna mikroskopija za životni vijek (FLIM) je sofisticirana tehnika koja može istovremeno snimiti vijek trajanja fluorescencije i prostornu lokaciju fluorofora na svakoj lokaciji na slici. Ova metoda pruža mehanizam za proučavanje parametara okoline kao što su pH, koncentracija jona, polaritet rastvarača, nekovalentne interakcije, viskozitet i tenzija kiseonika u pojedinačnim živim ćelijama i predstavlja podatke u prostornim i vremenskim nizovima. FLIM mjerenja životnog vijeka pobuđenog stanja na nanosekundnoj skali su nezavisna od lokalnih koncentracija fluorofora, efekata fotoizbjeljivanja i dužine putanje (debljine uzorka), ali su osjetljiva na reakcije pobuđenog stanja kao što je prijenos rezonantne energije. U stvari, kombinovanje FLIM-a sa FRET-om praćenjem životnih promena fluorescentnih donora pre i posle rezonantnog prenosa energije smatra se jednim od najboljih načina za proučavanje ovog fenomena.
Mobilnost (poprečni koeficijent difuzije) fluorescentno obilježenih makromolekula i malih fluorofora može se odrediti fluorescentnim obnavljanjem nakon tehnike fotobijeljenja (FRAP). U FRAP-u, vrlo malo odabrano područje (prečnika nekoliko mikrometara) se intenzivno osvjetljava, obično laserom, kako bi se proizvelo potpuno fotoizbjeljivanje fluorofora u tom području. Rezultat je dramatično smanjenje ili poništavanje fluorescencije. Nakon impulsa fotoizbjeljivanja, brzina i opseg oporavka intenziteta fluorescencije u izbijeljenim regijama praćeni su kao funkcija vremena pri niskim intenzitetima ekscitacije kako bi se generirale informacije o kinetici repopulacije i oporavka fluorofora (Slika 9). FRAP se obično izvodi pomoću EGFP ili drugih fluorescentnih proteina. Srodne tehnike fotoaktivacije baziraju se na specijalnim sintetičkim fluoroforima u kavezima ili slično funkcionalnim fluorescentnim proteinima koji se mogu aktivirati kratkim impulsima UV ili ljubičastog zračenja. Fotoaktivacija i FRAP se mogu koristiti kao komplementarne tehnike za određivanje parametara mobilnosti.
U tehnici vezanoj za FRAP, koja se zove gubitak fluorescencije nakon fotoizbjeljivanja (FLIP), definirana fluorescentna regija unutar žive ćelije podliježe ponovljenom fotoizbjeljivanju intenzivnim zračenjem. Ako bi svi fluorofori bili u stanju da difundiraju u područje koje se fotobijeli tokom mjerenog vremenskog perioda, to bi rezultiralo potpunim gubitkom fluorescentnog signala u cijeloj ćeliji. Izračunavanjem brzine kojom fluorescencija nestaje iz cijele ćelije, može se odrediti difuziona pokretljivost ciljnog fluorofora. Osim toga, FLIP može lako identificirati lokaciju i prirodu bilo koje difuzijske barijere između pojedinačnih odjeljaka stanica, kao što je barijera između some i aksona neurona.
Fluorescentna korelaciona spektroskopija (FCS), koja se uglavnom koristi u laserskoj skenirajućoj konfokalnoj mikroskopiji ili multifotonskoj mikroskopiji, je metoda dizajnirana da odredi kinetičke informacije kao što su brzine hemijskih reakcija, koeficijenti difuzije, tehnike za molekularnu težinu, brzinu protoka i agregaciju. U FCS, mali volumen (otprilike jedan femtometar; fokus lasera ograničen difrakcijom) je osvijetljen fokusiranim laserskim snopom kako bi se zabilježile fluktuacije intenziteta autofluorescencije izazvane dinamikom fluorescentnih molekula u funkciji vremena u zapremini koju zauzimaju fluorescentne stanice. molekule (slika 10). Relativno mali fluorofori brzo difundiraju u osvijetljenom volumenu, proizvodeći kratke rafale slučajnog intenziteta. Suprotno tome, veći kompleksi (fluorofori vezani za makromolekule) kreću se sporije, proizvodeći duže, postojanije obrasce intenziteta fluorescencije ovisne o vremenu.
Kada su fluorescentno označene strukture gusto zbijene i preklapaju se u određenim regijama živih ćelija, njihovu dinamiku i prostornu distribuciju je teško analizirati. Fluorescentna spot mikroskopija (FSM) je tehnika kompatibilna sa gotovo svim modalitetima snimanja koja koristi prednosti vrlo niske koncentracije fluorescentno obilježenih podjedinica, smanjuje fluorescenciju van fokusa i poboljšava vidljivost obilježenih struktura i njihovu dinamiku u debelim područjima. FSM-ovi se implementiraju označavanjem samo dijela cjelokupne strukture od interesa. U tom smislu, FSM je sličan izvođenju FCS u cijelom vidnom polju, iako stavlja veći naglasak na prostorne obrasce, a ne na kvantitativnu vremensku analizu. Fluorescentna spot mikroskopija je posebno korisna u određivanju pokretljivosti i agregacije citoskeletnih elemenata kao što su aktin i mikrotubule u hiperaktivnim stanicama.
Mikroskopija s osiromašenjem stimulirane emisije (STED) je nova tehnika super-rezolucije sa prostornom rezolucijom daleko iznad granice difrakcije, koristeći osiromašeno svjetlo u obliku prstena da okruži manji snop ekscitacijske svjetlosti kako bi se dobio sub-50 nm na osi do rezoluciju. Tehnika se oslanja na pobuđivanje fluorofora sinhronizovanim laserskim impulsima i prostorno koordinisanim kružnim STED impulsima koji iscrpljuju emitovano svetlo, potiskujući fluorescenciju pobuđenih molekula oko fokusa laserskog skeniranja. Fluorescencija stvorena na periferiji mrlje je potisnuta, ali ne i u centru mrlje, čime se značajno smanjuje veličina fluorescentne mrlje i shodno tome značajno povećava rezolucija. STED se pokazao korisnim alatom za detekciju živih ćelija visoke rezolucije. Druge nove tehnike super-rezolucije, kao što su fotoaktivirana lokalizaciona mikroskopija (PALM) i mikroskopija sa strukturiranim svjetlom (SIM), također će postati temeljni alati za snimanje živih ćelija u bliskoj budućnosti.
Sve veća upotreba genetski kodiranih fluorescentnih proteina i naprednih sintetičkih fluorofora za snimanje živih ćelija otvara vrata novim optičkim modalitetima za praćenje vremenske dinamike i prostornih odnosa. Mikroskopisti sada imaju kompletan skup alata za posmatranje i snimanje slikovnih podataka ćelijskih procesa koji se odvijaju u širokom rasponu vremenskih razmaka i u više rezolucija. Sporiji događaji se mogu lako uočiti i snimiti pomoću laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije, dok se brži kinetički događaji mogu dobiti pomoću tehnologije rotirajućih diskova. Osim toga, multifotonska mikroskopija omogućava duboko snimanje u debelim tkivima, a tehnike totalne unutrašnje refleksije omogućavaju sondiranje površina membrane sa konfokalnom preciznošću. Napredne metode fluorescencije, kao što su FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM i STED, mogu se koristiti za praćenje interakcija protein-protein pri rezolucijama često boljim od onih koje dozvoljava granica difrakcije. Sa napretkom u tehnologiji fluorofora, mikroskopa i detektora, širi svijet će biti doveden "pod mikroskop".
