Multifotonsko mikroskopsko snimanje: različite tehnike za snimanje neurona in vivo
U poređenju sa tradicionalnim jednofotonskim fluorescentnim mikroskopom širokog polja, multifotonska mikroskopija (MPM) ima funkcije optičkog sečenja i dubokog snimanja. U 2019., Jerome Lecoq i dr. raspravljali o srodnoj MPM tehnologiji iz tri aspekta: snimanje neurona duboko u mozgu, masivno snimanje neurona i snimanje neurona velike brzine.
Da bi se povezala aktivnost neurona sa složenim ponašanjem, obično je potrebno snimiti neurone u dubokom korteksu, što zahtijeva da MPM ima sposobnost dubokog snimanja. Ekscitacijsko i emisiono svjetlo će biti jako raspršeno i apsorbirano od strane biološkog tkiva, što je glavni faktor koji ograničava dubinu snimanja MPM-a. Iako se problem raspršenja može riješiti povećanjem intenziteta lasera, to će donijeti i druge probleme, kao što su sagorijevanje uzorka, defokusiranje i fluorescentna ekscitacija blizu površine. Najbolji način da se poveća dubina MPM slike je korištenje dužih talasnih dužina kao pobudnog svjetla.
Osim toga, za dvofotonsko (2P) snimanje, ekscitacija fluorescencije van fokusa i bliske površine su dva najveća faktora koji ograničavaju dubinu, dok su za trofotonsko (3P) snimanje ova dva problema znatno smanjena, ali trofotonsko snimanje zbog fluorescencije Poprečni presjek apsorpcije grupe je mnogo manji od onog kod 2P, tako da je potrebna za red veličine veća energija impulsa da bi se dobio signal fluorescencije istog intenziteta kao onaj koji je pobuđen 2P. Funkcionalna 3P mikroskopija je zahtjevnija od strukturne 3P mikroskopije, koja zahtijeva brže skeniranje kako bi se na vrijeme uzorkovala neuronska aktivnost; potrebna je veća energija impulsa kako bi se prikupilo dovoljno signala unutar vremena zadržavanja svakog piksela.
Kompleksna ponašanja često uključuju velike moždane mreže s lokalnim i daljinskim vezama. Da bi se aktivnost neurona povezala s ponašanjem, potrebno je istovremeno pratiti aktivnost vrlo velikih i široko rasprostranjenih neurona. Neuronska mreža u mozgu obrađuje dolazne podražaje u roku od nekoliko desetina milisekundi. Da bi se razumjela ova brza neuronska mreža Za proučavanje dinamike neurona, MPM mora imati sposobnost brzog snimanja neurona. Brze MPM metode se mogu podijeliti na tehnike skeniranja s jednim snopom i tehnike skeniranja s više zraka.
Tehnologija skeniranja sa jednim snopom omogućava brzi prelaz nervnog tkiva sa velikim vidnim poljem (FOV)
Kada koristite MPM za snimanje neurona, skeniranje nasumičnim pristupom – to jest, laserski snop se brzo skenira u bilo kojoj odabranoj tački u cijelom vidnom polju – može skenirati samo neurone od interesa, što ne samo da izbjegava skeniranje bilo kojeg neoznačenog Nervnog vlakna može također optimizira vrijeme skeniranja laserskog snopa. Skeniranje sa slučajnim pristupom (slika 1) može se postići pomoću akusto-optičkog deflektora (AOD), koji radi tako što se piezoelektrični pretvarač sa radio-frekventnim signalom vezuje za odgovarajući kristal. Rezultirajući akustični valovi indukuju periodičnu rešetku indeksa prelamanja. Difrakcija se javlja kada laserski snop prolazi kroz rešetku. Intenzitet i frekvencija zvučnog vala može se podesiti električnim signalom radio frekvencije kako bi se promijenio intenzitet i smjer difraktiranog svjetla, tako da se jednodimenzionalno horizontalno skeniranje proizvoljnih tačaka može realizirati korištenjem jednog AOD-a, a može se realizirati 3D korištenjem para AOD-a u kombinaciji s drugim tehnologijama aksijalnog skeniranja skeniranje nasumičnim pristupom. Međutim, ova tehnika je vrlo osjetljiva na kretanje uzorka i sklona artefaktima pokreta. Trenutno se široko koristi brzo rastersko skeniranje, odnosno progresivno skeniranje u FOV, jer algoritam može lako riješiti artefakte pokreta.
Dvofotonsko snimanje neokortikalnih L2/3 neurona in vivo zasnovano na AOD[2]
Postoji mnogo načina za realizaciju brzog rasterskog skeniranja, korištenjem vibrirajućeg ogledala za brzo 2D skeniranje, kombiniranjem vibrirajućeg ogledala i podesivog električnog sočiva za brzo 3D skeniranje, ali podesivo električno sočivo ne može brzo fokusirati u aksijalnom smjeru zbog ograničenja Prebacivanje mehaničke inercije, koje utiče na brzinu snimanja, sada se može zamijeniti prostornim svjetlosnim modulatorom (SLM).
Daljinsko fokusiranje je također sredstvo za postizanje 3D slike, kao što je prikazano na slici 2. U LSU modulu skenirajući galvanometar skenira horizontalno, a ASU modul uključuje sočivo objektiva L1 i ogledalo M, a aksijalno skeniranje se ostvaruje podešavanjem položaj M. Ova tehnika ne samo da može ispraviti optičku aberaciju koju uvodi sočivo glavnog objektiva L2, već i omogućiti brzo aksijalno skeniranje. Da bi se dobilo više neurona, FOV se može povećati podešavanjem dizajna sočiva objektiva mikroskopa, ali sočivo objektiva sa velikim NA i velikim FOV obično je teško i ne može se brzo kretati za brzo aksijalno skeniranje, tako da se veliki FOV sistemi oslanjaju na Telefocus , SLM i podesiva motorizirana sočiva.
Šematski dijagram dvofotonskog sistema za snimanje na daljinsko fokusiranje[3] Tehnologija skeniranja s više zraka može istovremeno snimiti različite položaje neuronskog tkiva
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm jedan od drugog) mjesta snimanja (sl. 3C,D); za susedne regione, obično koristi više snopova jednog sočiva objektiva za snimanje (sl. 3E,F). Tehnika skeniranja sa više snopova mora obratiti posebnu pažnju na problem preslušavanja između ekscitacionih snopova, koji se može riješiti metodom odvajanja izvora svjetlosti nakon svjetlosti ili metodom prostorno-vremenskog multipleksiranja. Post-hoc metoda razdvajanja izvora svjetlosti odnosi se na korištenje algoritama za odvajanje snopova radi eliminisanja preslušavanja; Metoda vremensko-prostornog multipleksiranja se odnosi na istovremenu upotrebu višestrukih ekscitacionih snopova, impulsi svakog snopa kasne u vremenu, tako da se pojedinačni snopovi pobuđeni različitim snopovima mogu privremeno razdvojiti. fluorescentni signal. Više neurona se može snimiti uvođenjem više zraka, ali višestruki snopovi će povećati preklapanje vremena raspada fluorescencije, što ograničava sposobnost razlikovanja izvora signala; a multipleksiranje negativno utiče na brzinu rada elektronskih uređaja. Visoki zahtjevi; veliki broj zraka također zahtijeva veću snagu lasera da bi se održao približan omjer signala i šuma jednog snopa, što može lako dovesti do oštećenja tkiva.
Tehnologija snimanja velikih površina
Posljednjih godina, razvoj različitih MPM tehnologija proširio je opseg našeg snimanja neuronskog tkiva, omogućavajući nam da snimimo više neurona duboko u mozgu bržom brzinom, što je uvelike promoviralo istraživanje neuronauke i omogućilo nam jasnije razumijevanje funkcije mozga.
