Tehnologija snimanja višefotonske mikroskopije: polarizacija-razriješena druga-mikroskopija druge harmonične generacije i njena obrada slike
U nelinearnim optičkim mikroskopima, snimanje drugog harmonika (SHG) se obično koristi za promatranje endogenih vlaknastih struktura, a intenzitet SHG u velikoj mjeri ovisi o relativnom kutu između smjera polarizacije upadnog snopa i orijentacijske ose ciljne molekule. Stoga, slikanje SHG zasnovano na polarizaciji (P-}SHG) može dobiti strukturne informacije ciljnih molekula analizom funkcionalnog odnosa između intenziteta SHG signala i stanja polarizacije upadnog zraka. Sada se koristi kao važan alat za medicinske i biološke analize.
Jednostavne SHG slike se mogu dobiti tradicionalnom fluorescentnom mikroskopom sa ekscitacijom sa dva-fotona (TPM). Većina TPM sistema još uvijek koristi metodu skeniranja jednog snopa zasnovanu na pokretnom ogledalu, čija vremenska rezolucija zavisi od fizičke brzine kretanja ogledala. Kako bi se postigla brža slika, TPM sistem također može usvojiti metodu skeniranja s više zraka (slika 1A), od kojih je jedna upotreba rotirajuće jedinice za skeniranje diska. Ova jedinica se sastoji od gramofona sa koaksijalnim mikro sočivima i gramofona s rupicama, pri čemu mikro sočiva i rupice na svakom gramofonu odgovaraju jedan-prema-jedan.
Kada laser prođe kroz okretni sto za mikro sočiva, talasna fronta pokriva više mikro sočiva. Različita mikro sočiva fokusiraju različite dijelove valnog fronta na različite položaje i prolaze kroz odgovarajuće rupice, formirajući više mikro zraka. Ovi mikro zraci koji udaraju u uzorak mogu istovremeno pobuditi više signala. Ovi signali se vraćaju duž sistema mikroskopa i ponovo prolaze kroz rupicu i konačno se reflektuju od dikroičnog ogledala između dva gramofona u uređaj za detekciju. Međutim, uobičajeni način rada-zaključanog titanijum-safirnog lasera kao izvora svjetlosti nema dovoljnu energiju, što ograničava broj ekscitacionih zraka i rezultira malim efektivnim vidnim poljem (FOV) za TPM (TPM-SD) pomoću rotacione jedinice za skeniranje.
Ai Goto i dr. ima za cilj postizanje velike-brzine P-SHG slike sa velikim vidnim poljem (FOV) koristeći TPM-SD sistem. Stoga je laserski izvor na bazi Yb sa većom vršnom snagom uveden u TPM-SD sistem.
Ovo je šematski dijagram TPM-SD sistema koji su razvili. Izvor svjetlosti sistema je laser baziran na Yb, koji generiše femtosekundne impulse sa centralnom talasnom dužinom od 1042 nm, prosečnom snagom od 4 W, širinom impulsa od 300 fs i stopom ponavljanja od 10 MHz. Sistem prvo podešava snagu lasera kroz polutalasnu ploču i Glan laserski polarizator, a zatim širi snop kroz ekspander snopa. Prošireni snop se uvodi u gramofonsku jedinicu za skeniranje, a višestruki mikro snopovi koji izlaze iz jedinice za skeniranje fokusiraju se na više tačaka uzorka kroz sočivo objektiva sa potapanjem u vodu. Da bi se podesilo stanje polarizacije svetlosnog snopa na sočivu objektiva, na optički put ekscitacionog snopa postavljaju se polutalasna ploča i četvrttalasna ploča.
