Priprema i posmatranje bioloških uzoraka za elektronsku mikroskopiju
Rezolucija mikroskopa zavisi od talasne dužine svetlosti koja se koristi. Elektronski mikroskop, koji je počeo da se pojavljuje 1933. godine, koristi elektronski snop sa talasnom dužinom mnogo kraćom od one vidljive svetlosti kao izvor svetlosti, tako da je rezolucija koju može postići znatno poboljšana u odnosu na optički mikroskop. Razlika u izvorima svjetlosti također određuje niz razlika između elektronskih i optičkih mikroskopa.
U skladu sa razlikama u principima snimanja elektronskim snopom i različitim načinima djelovanja na uzorke, moderni elektronski mikroskopi su se razvili u više tipova. Trenutno se najčešće koriste transmisioni elektronski mikroskopi i skenirajući elektronski mikroskopi. Ukupno povećanje prvog može biti između 1000-1000000. Ukupno povećanje potonjeg može varirati između 20 i 300,000 puta. Ovaj eksperiment uglavnom uvodi pripremu dvije vrste mikroskopskih uzoraka, transmisionog elektronskog mikroskopa i skenirajućeg elektronskog mikroskopa.
2. Oprema
1. Bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) koso.
2. Rastvor ili reagens amil acetat, koncentrovana sumporna kiselina, apsolutni etanol, sterilna voda, 2% natrijum fosfotungstata (pH 6.5-8.0) vodeni rastvor, 0.3% polietilen rastvor formaldehida (rastvorljiv u hloroformu), ćelije Pigment c, amonijum acetat, plazmid pBR322.
3. Instrumenti ili drugi pribor: obični optički mikroskop, bakarna mreža, porculanski lijevak, čaša, posuda, sterilna kapaljka, sterilne pincete, igle, dijapozitivi, ploča za brojanje, mašina za vakuumsko oblaganje, sušač za kritičnu tačku itd.
3. Operativni koraci
(1) Priprema uzorka i posmatranje za transmisijsku elektronsku mikroskopiju
1. Tretman metalne mreže
Uzorak za optičku mikroskopiju stavlja se na staklo za posmatranje. Međutim, u transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji, budući da elektroni ne mogu prodrijeti kroz stakleni lim, mrežasti materijali se mogu koristiti samo kao nosači, koji se obično nazivaju nosećim mrežama. Noseća mreža se može podijeliti na mnogo različitih specifikacija zbog različitih materijala i oblika, među kojima je najčešće korištena 200-400 mreža (broj rupa) bakarna mreža. Bakarna mreža se mora tretirati prije upotrebe kako bi se uklonila prljavština i održala čistom, inače će utjecati na kvalitetu potpornog filma i jasnoću fotografija uzoraka. U ovom eksperimentu se koristi 400-mrežasta bakrena mreža, koja se može tretirati na sljedeći način: prvo je natopite i izbijelite amil acetatom nekoliko sati, zatim je nekoliko puta isperite destilovanom vodom, a zatim potopite u apsolutni etanol za dehidracija. Ako bakarna mreža i dalje nije čista nakon gore navedenih metoda, možete je potopiti u razrijeđenu koncentrovanu sumpornu kiselinu (1:1) na 1 do 2 minute, ili je prokuvati u 1% otopini NaOH nekoliko minuta, isprati je destiliranom vode nekoliko puta, a zatim stavite u bezvodni dehidrat u etanolu i ostavite sa strane.
2. Priprema potporne membrane
Prilikom posmatranja uzoraka, noseću mrežu također treba prekriti slojem nestrukturiranog, jednolikog filma, inače će mali uzorci iscuriti iz otvora mreže nosača. Ovaj film se obično naziva noseći film ili noseći film. Noseći film bi trebao biti proziran za elektrone, a njegova debljina općenito bi trebala biti manja od 20 nm; pod utjecajem elektronskog snopa, film također treba imati određenu mehaničku čvrstoću kako bi održao strukturnu stabilnost i imao dobru toplinsku provodljivost; osim toga, mreža za podršku treba da se koristi u elektronskoj mikroskopiji. Ispod ne bi trebalo biti vidljive strukture, nikakve hemijske reakcije sa uzorkom koji se nosi, niti smetnji u posmatranju uzorka. Njegova debljina je općenito oko 15 nm. Noseći film može biti plastična folija (kao što je kolodijska folija, polietilen formaldehidna folija, itd.), Ugljična folija ili metalna folija (kao što je berilijumska folija, itd.). U normalnim radnim uslovima, plastična folija može zadovoljiti zahtjeve. Među plastičnim folijama, kolodijski film je relativno jednostavan za pripremu, ali njegova čvrstoća nije tako dobra kao polietilen formaldehidna folija.
