Princip i primjena fluorescentne mikroskopije
(1) Princip i strukturne karakteristike fluorescentnog mikroskopa: fluorescentni mikroskop koristi tačkasti izvor svetlosti sa visokom svetlosnom efikasnošću da emituje svetlost određene talasne dužine (kao što je ultraljubičasto svetlo 3650 in ili ljubičasto plavo svetlo 4200 in) kroz sistem filtera kao pobudna svjetlost koja pobuđuje uzorak. Nakon što fluorescentna supstanca iznutra emituje fluorescenciju različitih boja, ona se posmatra kroz uvećanje objektiva i okulara. Na ovaj način, pod jakom kontrastnom pozadinom, čak i ako je fluorescencija vrlo slaba, lako se prepoznaje i ima visoku osjetljivost. Uglavnom se koristi za istraživanje strukture i funkcije ćelije i hemijskog sastava. Osnovna struktura fluorescentnog mikroskopa sastoji se od običnog optičkog mikroskopa plus neke dodatne opreme (kao što je fluorescentni izvor svjetlosti, ekscitacijski filter, dvobojni razdjelnik zraka i filter za blokiranje, itd.). Fluorescentni izvor svjetlosti - općenito se koristi živina lampa ultra visokog pritiska (50-200W), koja može emitovati svjetlost različitih talasnih dužina, ali svaka fluorescentna supstanca ima talasnu dužinu ekscitacije koja proizvodi najjaču fluorescenciju, pa je potrebno dodati ekscitacioni filter (Općenito, postoje ultraljubičasti, ljubičasti, plavi i zeleni ekscitacioni filteri), koji dozvoljavaju samo ekscitacionoj svetlosti određene talasne dužine da prođe i ozrači uzorak, dok apsorbuje drugu svetlost. Nakon što je svaka supstanca ozračena ekscitacionim svjetlom, emituje vidljivu fluorescenciju sa većom valnom dužinom od talasne dužine zračenja za vrlo kratko vrijeme. Fluorescencija je specifična i općenito slabija od ekscitacijske svjetlosti. Da bi se uočila specifična fluorescencija, potreban je filter za blokiranje (ili potiskivanje) iza objektiva. Ima dvije funkcije: jedna je da apsorbira i blokira ekscitacijsko svjetlo od ulaska u okular, kako ne bi poremetilo fluorescenciju i oštetilo oči; drugi je odabrati i pustiti da određena fluorescencija prođe, pokazujući određenu fluorescentnu boju. Dva filtera se moraju koristiti zajedno.
Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa u smislu njihovog optičkog puta:
1. Transmisioni fluorescentni mikroskop: Izvor ekscitacije pobuđuje fluorescenciju kroz materijal uzorka kroz kondenzatorsko sočivo. Obično se koristi kolektor tamnog polja, a obični kolektor se također može koristiti za podešavanje ogledala tako da se pobudna svjetlost prenosi i premošćuje do uzorka. Ovo je staromodni fluorescentni mikroskop. Prednost je što je fluorescencija jaka pri malom uvećanju, a nedostatak je što fluorescencija opada sa povećanjem povećanja. Stoga je bolje posmatrati veće materijale uzoraka.
2. Epifluorescentni mikroskop Ovo je novi tip fluorescentnog mikroskopa razvijen u moderno doba. Razlika je u tome što ekscitacijsko svjetlo pada sa sočiva objektiva na površinu uzorka, odnosno isto sočivo objektiva se koristi kao kondenzator osvjetljenja i objektiv objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik snopa treba dodati u putanju svjetlosti, koja je udaljena 45 stepeni od laganog uranijuma. Ekscitacijsko svjetlo se reflektira u objektiv objektiva i sakuplja na uzorku. Fluorescencija koju generira uzorak i pobuđujuća svjetlost reflektirana od površine sočiva objektiva i površine pokrovnog stakla ulaze u sočivo objektiva u isto vrijeme i vraćaju se na dvobojni razdjelnik zraka kako bi pobudno svjetlo bilo odvojeno od fluorescencije , preostala pobudna svjetlost se apsorbira blokirajućim filterima. Ako pređete na kombinaciju različitih ekscitacionih filtera/dvobojnih razdjelnika zraka/filtara za blokiranje, mogu se zadovoljiti potrebe različitih fluorescentnih reakcijskih proizvoda. Prednost ove vrste fluorescentnog mikroskopa je u tome što je osvjetljenje vidnog polja ujednačeno, slika jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
(2) Kako koristiti fluorescentni mikroskop.
1. Uključite izvor svetlosti, živina lampa ultra visokog pritiska treba da se zagreje nekoliko minuta da bi došla do najsjajnije tačke.
2. Za transmisioni fluorescentni mikroskop, između izvora svjetlosti i kondenzatora treba instalirati potreban filter za pobuđivanje, a iza sočiva objektiva treba postaviti odgovarajući filter za blokiranje. Epifluorescentni mikroskopi moraju da umetnu potrebni filter za pobuđivanje/umetke za razdvajanje snopa u dve boje/filter za blokiranje u proreze na putu svetlosti.
3. Posmatrajte sočivom sa malim uvećanjem i podesite centar izvora svetlosti prema uređaju za podešavanje različitih tipova fluorescentnih mikroskopa tako da se nalazi u centru čitave tačke osvetljenja.
4. Postavite list uzorka i posmatrajte nakon fokusiranja. Prilikom upotrebe treba obratiti pažnju: Ne posmatrajte direktno krajnjim filterom, kako ne biste oštetili oči; kada se uzorak posmatra uljnim sočivom, mora se koristiti posebna uljna leća bez fluorescencije; nakon što se živina lampa visokog pritiska isključi, ne može se odmah ponovo uključiti i potrebno je testirati. Može se ponovo pokrenuti nakon 5 minuta, inače će biti nestabilan i utjecati na vijek trajanja živine lampe.
(3) Posmatranje Koristeći plavo-ljubičasti svjetlosni filter pod fluorescentnim mikroskopom na platformi za učenje, može se vidjeti da su ćelije obojene sa 0,01 posto akridin narandžaste fluorescentne boje, jezgro i citoplazma pobuđene da proizvode dvije različite boje fluorescencija (tamno) zelena i narandžasto-crvena).
