Princip i konstrukcija fluorescentnog mikroskopa
Fluorescencijski mikroskop koristi tačkasti izvor svjetlosti visoke luminozne efikasnosti, koji emituje određenu talasnu dužinu svjetlosti (kao što je ultraljubičasto svjetlo 3650 in ili ljubičasto plavo svjetlo 4200 in) kroz sistem filtriranja boja kao ekscitacijsko svjetlo i pobuđuje fluorescentne supstance u uzorku da emituju različite boje fluorescencije. Nakon toga se posmatra kroz uvećanje objektiva i okulara. Na taj način, čak i sa slabom fluorescencijom, lako je prepoznatljiv i vrlo osjetljiv pod jakim kontrastnim pozadinama, uglavnom se koristi za proučavanje strukture i funkcije ćelije, kao i hemijskog sastava. Osnovna struktura fluorescentnog mikroskopa sastoji se od običnog optičkog mikroskopa i nekih dodataka (kao što su fluorescentni izvor svjetlosti, ekscitacijski filter, bihromatski separator zraka i filter za blokiranje, itd.). Fluorescentni izvori svjetlosti - obično koriste živine lampe ultra visokog pritiska (50-200W), koje mogu emitovati svjetlost različitih talasnih dužina. Međutim, svaka fluorescentna supstanca ima talasnu dužinu pobuđivačke svetlosti koja proizvodi najjaču fluorescenciju, tako da je potrebno dodati filtere za pobuđivanje (obično ultraljubičasti, ljubičasti, plavi i zeleni ekscitacioni filteri) kako bi se omogućilo samo određenoj talasnoj dužini pobuđenog svetla da prođe i osvetli uzorak, dok apsorbuje svu drugu svjetlost. Nakon što je ozračena pobuđenom svjetlošću, svaka supstanca emituje vidljivu fluorescenciju sa većom talasnom dužinom od zračenja u vrlo kratkom vremenskom periodu. Fluorescencija ima specifičnost i općenito je slabija od ekscitacijske svjetlosti. Da bi se uočila specifična fluorescencija, potrebno je dodati filter za blokiranje (ili potiskivanje) iza objektiva. Ima dvije funkcije: prvo, apsorbira i blokira ekscitacijsko svjetlo da uđe u okular kako bi se izbjeglo remećenje fluorescencije i oštećenje očiju; drugo, odabire i dozvoljava prolazak specifične fluorescencije, prikazujući određenu boju fluorescencije. Oba tipa filtera moraju se odabrati za upotrebu zajedno.
Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa na osnovu njihovog optičkog puta:
1. Transmisioni fluorescentni mikroskop: Izvor ekscitacije svjetlosti se prenosi kroz materijal uzorka kroz kondenzator kako bi pobudio fluorescenciju. Uobičajeni kolektori tamnog polja ili obični kolektori svjetlosti mogu se koristiti za podešavanje reflektora za pretvaranje pobudne svjetlosti i bočne svjetlosti na uzorak. Ovo je relativno staromodan fluorescentni mikroskop. Njegova prednost je što je fluorescencija jaka pri malom uvećanju, dok je nedostatak što fluorescencija slabi sa povećanjem povećanja. Stoga je bolje posmatrati veće materijale uzoraka.
2. Fluorescencijski mikroskop sa padajućim snopom Ovo je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Za razliku od prethodnog, ekscitacijsko svjetlo pada sa sočiva objektiva na površinu uzorka, koristeći isto sočivo objektiva kao kondenzator osvjetljenja i objektiv objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dvobojni separator snopa treba dodati na optičku putanju, koja je pod uglom od 45 stepeni u odnosu na lagani uranijum. Ekscitacijsko svjetlo se reflektira u sočivo objektiva i koncentriše na uzorak. Fluorescencija koju generira uzorak, kao i ekscitacijsko svjetlo reflektirano od površine sočiva objektiva i pokrovnog stakla, istovremeno ulaze u sočivo objektiva i vraćaju se u separator dikroičnog snopa, razdvajajući ekscitaciju i fluorescenciju. Preostalo uzbuđenje tada apsorbuje filter za blokiranje. Ako se koriste različite kombinacije ekscitacionih filtera/dvobojnih separatora zraka/blokirajućih filtera, oni mogu zadovoljiti potrebe različitih fluorescentnih reakcijskih proizvoda. Prednost ovog fluorescentnog mikroskopa je u tome što je vidno polje ujednačeno, slika je jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
