Principi laserske konfokalne mikroskopije (LSCM)
Laserski konfokalni mikroskop koristi otvor za osvjetljavanje postavljen iza izvora svjetlosti i rupicu za detekciju postavljenu ispred detektora kako bi se postiglo osvjetljenje tačke i detekcija tačke. Svjetlost iz izvora svjetlosti fokusira se na tačku u fokalnoj ravni uzorka pomoću svjetlosti koja se emituje kroz otvor za osvjetljenje, a fluorescencija emitirana iz te tačke se snima unutar otvora za detekciju, a svako emitirano svjetlo izvan te tačke blokira se pinhole za otkrivanje. Rupa za osvjetljenje i rupica za detekciju su konjugirani za osvijetljenu ili detektovanu tačku, tako da je detektovana tačka konfokalna tačka, a ravan u kojoj se detektovana tačka nalazi konfokalna ravan. Računar prikazuje otkrivenu tačku na ekranu računara u obliku tačke slike. Da bi se proizvela potpuna slika, sistem za skeniranje na optičkoj putanji skenira preko fokalne ravni uzorka, čime se proizvodi potpuna konfokalna slika. Sve dok se stepen nosioca pomera gore-dole duž Z-ose, novi nivo uzorka se pomera u konfokalnu ravan, a novi nivo uzorka se snima na monitoru, dok Z-osa nastavlja da se pomeranja, dobijaju se uzastopne svetlosne slike različitih nivoa uzorka.
Tradicionalni optički mikroskop koristi izvor svjetlosti polja, slika svake tačke na uzorku će biti ometena difrakcijom ili raspršenjem svjetlosti od susjednih tačaka; laserski skenirajući konfokalni mikroskop koristi laserski snop kroz osvijetljeni otvor za formiranje točkastog izvora svjetlosti na uzorku skeniranom u svakoj tački unutrašnje žarišne ravni, uzorak na ozračenoj tački, slikanje rupice za detekciju, detekcijom rupice nakon što se cev za umnožavanje svetlosti (PMT) ili uređaj sa hladnim elektrospojom (cCCD) primi tačku po tačku ili liniju po liniju, fluorescentna slika se brzo formira na ekranu monitora računara. Rupica za osvjetljenje i rupica za detekciju u odnosu na žižnu ravninu objektivnog sočiva su konjugirana, tačka na žarišnoj ravni je istovremeno fokusirana na rupicu za osvjetljenje i emisionu rupicu, tačka izvan žižne ravnine neće biti u detekciji pinhole na snimanju, tako da dobijena konfokalna slika predstavlja optički poprečni presek uzorka, prevazilazeći nedostatke nejasne slike običnog mikroskopa.
Od osnovnog principa, laserski konfokalni mikroskop je moderan optički mikroskop, to je obični svjetlosni mikroskop iz tehnologije za sljedeća poboljšanja.
1. Koristite laser kao izvor svjetlosti jer je monokromatizam lasera vrlo dobar, talasna dužina snopa izvora svjetlosti je ista, što u osnovi eliminira kromatsku aberaciju.
2. Upotreba konfokalne tehnologije u fokalnoj ravni objektivnog sočiva postavljenog u sredini sa malom rupom u pregradi, fokalna ravan izvan zalutalog svjetla blokira, eliminirajući sfernu aberaciju; i dalje eliminisati hromatsku aberaciju.
3. Laserski konfokalni mikroskop koji koristi tehnologiju skeniranja tačaka za razlaganje uzorka u dvodimenzionalni ili trodimenzionalni prostor na bezbroj tačaka, sa vrlo malim laserskim snopom (tačkasti izvor svjetlosti) tačku po tačku, liniju po liniju skenirajući sliku, a zatim kroz mikrokompjuterska kombinacija cijele ravnine ili trodimenzionalne slike. Tradicionalni svjetlosni mikroskop je izvor svjetlosti na terenu pod jednokratnim snimanjem, uzorci na svakoj tački slike bit će susjedni tački difrakcije svjetlosti i interferencije raspršene svjetlosti. Jasnoća i preciznost ove dvije slike se ne mogu porediti.
4. Akvizicija i obrada optičkih signala kompjuterom i pojačanje signala fotomultiplikatorom
U laserskom konfokalnom mikroskopu, kompjuter zamjenjuje ljudsko oko ili kameru za posmatranje i video snimanje, a dobivene slike se digitaliziraju i mogu se obraditi u kompjuteru kako bi se ponovo poboljšala jasnoća slika. Štaviše, upotreba fotomultiplikatora može pojačati vrlo slabe signale, značajno poboljšavajući osjetljivost. Kao rezultat kombinovane upotrebe navedenih tehnologija, može se reći da je LSCM najnapredniji mikroskop na svetu. Može se reći da je LSCM kombinacija tehnologije proizvodnje mikroskopa, fotoelektrične tehnologije, kompjuterske tehnologije**, neizbježan proizvod razvoja moderne tehnologije.
