Zahtjevi za pripremu uzoraka za fluorescentnu mikroskopiju
Zahtjevi za pripremu uzorka za fluorescentnu mikroskopiju
(1) Stakleni tobogan
Debljina kliznog stakla treba biti između 0.8-L2mm. Predebeo klizač će apsorbirati više svjetla s jedne strane i ne može fokusirati pobudno svjetlo na uzorak s druge strane. Stakalca moraju biti glatka, ujednačene debljine i bez očigledne autofluorescencije. Ponekad se koriste kvarcni tobogani.
(2) Poklopno staklo
Debljina pokrovnog stakla je oko 0.17 mm, glatko. Kako bi se pojačalo pobudno svjetlo, može se koristiti i interferentno pokrivno staklo, koje je posebno pokrovno staklo presvučeno s nekoliko slojeva tvari (kao što je magnezij fluorid) koje imaju različite interferentne efekte na svjetlost različitih valnih dužina, što može uzrokovati fluorescencija glatka. Ekscitacijsko svjetlo prolazi kroz njega, a pobudna svjetlost se reflektira, a ova reflektovana pobudna svjetlost može pobuditi uzorak.
(3) Primerak
Kriške tkiva ili drugi uzorci ne bi trebali biti previše debeli. Ako je debljina predebela, najveći dio ekscitacijske svjetlosti će se potrošiti u donjem dijelu uzorka, dok gornji dio direktno posmatran od sočiva objektiva ne može biti u potpunosti pobuđen. Osim toga, fluorescencija uzrokovana preklapanjem ćelija ili nečistoćama, pozadinsko nespecifično bojenje utječe na prosudbu.
(4) ulje za ogledalo
Općenito, kada se uzorci promatraju fluorescentnim mikroskopima tamnog polja i mikroskopima za uranjanje u ulje, mora se koristiti ulje za uranjanje. Najbolje je koristiti specijalno nefluorescentno ulje za uranjanje. Umjesto toga se može koristiti i glicerin, a može se koristiti i tekući parafin, ali je indeks loma nizak, što ima blagi utjecaj na kvalitetu slike.
Razumijevanje svjetlosne kocke fluorescentne mikroskopije
Fluorescencija je svjetlost kojom elektroni u tvari apsorbiraju svjetlosnu energiju iz niskoenergetskog stanja u stanje visoke energije, a zatim oslobađaju svjetlost kada se vrati u stanje niske energije. To je netemperaturna svjetlost - luminiscencija. To jest: supstanca apsorbuje kratkotalasnu svetlost, ulazi u pobuđeno stanje i emituje dugotalasnu svetlost.
Bilo da se radi o autofluorescenciji supstance, fluorescentnoj boji ili fluorescentnom proteinu izraženom fuzijom, ona mora biti pobuđena specifičnom talasnom dužinom svetlosti (ekscitacija). Nakon što elektroni migriraju i izgube energiju, emituju svjetlost određene duge valne dužine (Emisija). , koje može prikupiti sistem za detekciju kako bi se postigla funkcija identifikacije specifične fluorescencije.
Šta je fluorescentna svjetlosna kocka?
U posmatranju i snimanju fluorescentnim mikroskopom, ekscitacijsko svjetlo određene valne dužine i odgovarajuća dugovalna emisiona svjetlost osigurava kocka fluorescentnog svjetla, tako da se fluorescentni signal može prikupiti golim okom, ekranom ili kamerom. Stoga, fluorescentna svjetlosna kocka određuje šta se može detektovati. Ključni uređaj fluorescentnog signala, njegove karakteristike uključuju EX: parametre filtera talasne dužine ekscitacije, EM: parametre filtera talasne dužine emisije i DM: parametre dihotomnog ogledala. Uzmite DAPI svjetlosnu kocku Revolve integriranog fluorescentnog mikroskopa kao primjer, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm svjetlost se može prenijeti na EM; EM emisioni filteri se koriste za odvajanje fluorescencije koju emituje fluorofor od ostalih pozadinskih optičkih elemenata za odvajanje svjetlosti. Emisioni filteri prenose svjetlost na talasnoj dužini fluorescencije kroz dikroično ogledalo dok blokiraju svu drugu svjetlost koja curi iz izvora pobudne svjetlosti (odbijena od uzorka ili optike). Emitovana talasna dužina svetlosti je veća od EM koju treba posmatrati, odnosno samo svetlost u opsegu od 450±25nm ulazi u sistem detekcije. Odgovarajući odabir EX, EM filtera i DM dihotomija može pomoći istraživačima da postignu veće omjere signal-šum (S/N).
