Tehničke karakteristike i veštine upotrebe dvofotonskog fluorescentnog mikroskopa
Dvofotonska fluorescentna mikroskopija je nova tehnologija koja kombinuje lasersku skenirajuću konfokalnu mikroskopiju i tehnologiju dvofotonske ekscitacije.
Osnovni princip dvofotonske pobude je: u slučaju velike gustine fotona, fluorescentne molekule mogu istovremeno apsorbirati dva fotona duge talasne dužine i emitovati foton kraće talasne dužine nakon kratkog perioda života u takozvanom pobuđenom stanju. . ; Efekat je isti kao da koristite foton sa talasnom dužinom upola manjom od duge talasne dužine da pobudite fluorescentni molekul. Dvofotonsko pobuđivanje zahtijeva veliku gustinu fotona. Kako se ćelije ne bi oštetile, dvofotonska mikroskopija koristi impulsne lasere sa zaključavanjem moda visoke energije. Laser koji emituje ovaj laser ima visoku vršnu energiju i nisku prosječnu energiju, širina impulsa mu je samo 100 femtosekundi, a period može doseći 80 do 100 megaherca. Kada koristite objektiv objektiva sa velikim numeričkim otvorom za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera, gustina fotona u fokusnoj tački objektivnog sočiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija se javlja samo u fokusnoj tački objektivnog sočiva, tako da dvofotonskom mikroskopu nije potrebna konfokalna rupica, što poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije. To je važna istraživačka metoda u oblastima morfologije, molekularne biologije ćelija, neuronauke i farmakologije.
1. Pozadina nastanka dvofotonske mikroskopije - dva ograničenja tradicionalne laserske konfokalne mikroskopije:
1) Jedan je fenomen fototoksičnosti: jer konfokalna rupica mora biti dovoljno mala da bi se dobila slika visoke rezolucije, a mali otvor će blokirati veliki dio fluorescencije koja se emituje iz uzorka, uključujući fluorescenciju emitiranu iz žarišne ravni, odgovarajuće Da, pobudna svjetlost mora biti dovoljno jaka da dobije dovoljan omjer signal-šum; a laser visokog intenziteta će uzrokovati da fluorescentna boja brzo izblijedi tokom kontinuiranog skeniranja, a fluorescentni signal će postati sve slabiji kako skeniranje napreduje.
2) Fototoksičnost je još jedan problem. Pod laserskim zračenjem, mnoge molekule fluorescentne boje proizvodit će citotoksine poput singletnog kisika ili slobodnih radikala, tako da vrijeme skeniranja i gustinu optičke snage ekscitacijske svjetlosti treba ograničiti u eksperimentu kako bi se održala gustina uzorka. aktivan. U istraživanju aktivnih uzoraka, posebno različitih faza rasta i razvoja aktivnih uzoraka, fotoizbjeljivanje i fototoksičnost čine ove studije vrlo ograničenim.
2. Zašto kažete da dvofotonski mikroskopi općenito ne moraju biti opremljeni ultraljubičastim ekscitacijskim laserima?
Dvofotonska mikroskopija je tehnologija pobuđivanja fluorescencije zasnovana na efektu dvofotonske ekscitacije: molekule fluorescentne boje mogu se pobuditi apsorbiranjem dva fotona niske energije u isto vrijeme (vremenski interval između dva fotona koji dosegnu fluorescentne molekule je manji od 1 femtosekunde ), njegov efekat pobuđivanja može biti ekvivalentan apsorpciji fotona visoke energije od 1/2 talasne dužine. Na primjer, apsorpcija dva fotona na crvenim talasnim dužinama je ekvivalentna molekuli koja apsorbuje ultraljubičasto. Fotone duge talasne dužine ćelije ne apsorbuju lako, pa je fototoksičnost za žive ćelije smanjena, a fotoizbeljivanje je takođe smanjeno. Na taj način ne samo da igra funkciju ultraljubičaste ekscitacije, već i izbjegava oštećenje uzorka ultraljubičastom svjetlošću.
3. Šta je posebno kod lasera dvofotonskog mikroskopa?
Vjerovatnoća dvofotonske apsorpcije ovisi o tome koliko se blisko dva upadna fotona poklapaju u prostoru i vremenu (dva fotona moraju stići u roku od 10-18 sekundi). Poprečni presjek dvofotonske apsorpcije je mali i pobuđuju se samo fluorofori u područjima s velikim fotonskim fluksom. Stoga, većina lasera koji se koriste su titan safir laseri, koji mogu postići pikosekundne ili femtosekundne brzine skeniranja, i imaju vrlo veliku vršnu snagu i nisku prosječnu snagu, tako da se fotoizbjeljivanje i fototoksičnost mogu smanjiti ili eliminirati. Najvažnije je obezbediti veoma visoku gustinu fotona u malom opsegu, što može da obezbedi istovremenu pobudu dva fotona.
4. Koje su prednosti dvofotonske pobude?
1) Povećajte selektivnost boje: raspon svjetlosti ekscitacije lasera konfokalnog sistema (Ar, Ar/Kr, HeNe) je 488nm - 647nm. To znači eksperimentiranje sa UV pobuđenim fluorescentnim bojama, npr. sa DAPI, Hoescht. Talasna dužina ekscitacije dvofotona je dvostruko veća od jednofotonske, tako da boje pobuđene ultraljubičastim zracima mogu biti pobuđene bliskom infracrvenom svjetlošću.
2) Smanjite fotoizbjeljivanje: Zbog smanjenja fotoizbjeljivanja, povećava se stopa uspjeha eksperimenata koji koriste CFP/YFP za prijenos energije fluorescentne rezonance (FRET).
3) Nije potrebno posebno sočivo objektiva: Sa hardverske tačke gledišta, ekscitacija UV pobuđenih boja talasnom dužinom bliske infracrvene svetlosti ne zahteva posebne UV optičke komponente.
4) Poboljšajte odnos signal-šum: talasna dužina pobuđene svetlosti i talasna dužina emitovane svetlosti imaju veliku razliku, što poboljšava odnos signal-šum.
5) Izbjeljivanje lokalizirano na žarišnoj tački: Budući da se ekscitacija fluorescencije događa samo u fokusnoj tački objektiva, nema potrebe za konfokalnom otvorom. Ovo poboljšava detekciju svjetlosti i fotoizbjeljivanje se događa samo u žarišnoj tački.
6) Lakše prodiranje u uzorke: Infracrvena svjetlost talasne dužine se ne raspršuje lako od strane ćelija i može prodrijeti u dublje uzorke.
5. U poređenju sa laserskom skenirajućom konfokalnom mikroskopijom, koje je najveće poboljšanje postignuto dvofotonskom mikroskopom?
1) Smanjeno fotoizbjeljivanje.
2) Smanjena fototoksičnost.
3) Nije lako raspršiti, a lakše je prodrijeti u debele uzorke, kao što su kriške mozga.
