Razlika između (dva fotona, konfokalna) fluorescentna mikroskopa i običan mikroskop
Osnovni princip dvotonskog uzbuđenja je taj što u visokoj gustini fotona, fluorescentni molekuli mogu istovremeno apsorbirati dvije duge fotone valne duljine i emitirati kraću fotonu valne duljine nakon kratkog razdoblja zagrijanog uzbuđenog stanja života; Učinak je isti kao i korištenje fotona sa pola talasne dužine duge talasne dužine za uzbudljiv fluorescentni molekuli. Dvije uzbuđenje fotona zahtijeva visoku gustoću fotona i kako bi se izbjegle oštećene ćelije, dvotonska mikroskopija koristi impulsni laseri koji su zaključani na režimu visoko energije. Laser koji emitira ovaj laser ima visoku vršku energije i nisku prosječnu energiju, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvenciji do 80 do 100 megahertza. Kada koristite visoku numeričku objektivu blende za fokusiranje fotona pulsiranog lasera, gustoća fotona na žarišnom mjestu objektiva je najviša, a dva fotonovna uzbuna javlja se samo na žarišnom mjestu objektivnog objektiva. Stoga dvotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalnu pilingu koja poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije.
Opće fluorescenjske pojave, zbog niske gustoće ekscitacije uzbuđenja, fluorescentni molekul može apsorbirati jedan foton samo i zatim emitirati još jedan fluorescentni foton kroz zračno prelazak, koji je poznat kao pojedinačna fluorescencija. Za procese uzbudljivih fluorescencija koje koriste lasere kao izvore svjetla, mogu se pojaviti dvije fotonske ili čak multipotonske fluorescencije. U ovom slučaju, izvor uzbuđenja koji se koristi ima visoku intenzitetu i gustoću fotona koja ispunjava zahtjev za fluorescentnim molekulama da istovremeno apsorbiraju dva fotona. U procesu korištenja općeg laserskog lasera kao izvor ekscitacije, gustoća fotona još uvijek nije dovoljna za proizvodnju fenomena apsorpcije s dva fotona. Obično se koriste femtosecond puls laseri, s trenutnom napajanjem koji dostiže nivo megavata. Stoga je talasna dužina dvotonske fluorescence kraće od uzbuđenja eksplicita, ekvivalentna efekta proizvedenom po pol uzbudljivom pobuđivanju valnog dužnosti.
Znanje vezano za konfokalno fluorescentno mikroskopiju
Osnovni princip konfokalne fluorescencije mikroskopije je korištenje tačke svjetla za ozračenje uzorka, čime se oblikova dobro definirano malo svjetlosno mjesto na žarišnoj ravnini. Fluorescencija koja se emitira s ovog mjesta nakon zračenja prikuplja se objektivnim objektivom i vraća se natrag izvornim zračenjem do razdjelnika snopa sastavljenog od dihroičnog ogledala. Spektrometar šalje fluorescenciju direktno detektoru. Ispred izvora svjetla i detektora nalazi se priključak, nazvan otvor za osvjetljenje i otvor za otkrivanje. Geometrijske dimenzije njih dvoje su dosljedne, otprilike {1}} nm; U usporedbi s svjetlosnim mjestom na žarišnom ravninu, to dvoje su konjugirani, što znači da svjetlosno mjesto prolazi kroz niz sočiva i može se u konačnici fokusirati i na rupu za osvjetljenje i rupu za osvjetljenje istovremeno. Na taj se način svjetlost iz žarišne ravnine može konvergirati u rasponu otvora za otkrivanje, dok je razbacana svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokirana izvan otvora za otkrivanje i ne može se dobiti. Skeniranjem uzorka točke s laserom, fotomoproviziranje cijevi nakon otkrivanja prikladne konfokalne slike svjetlosne tačke tačke po tački, pretvara ga u digitalni signal i na kraju ga prenosi u čistu konfokalnu sliku na ekranu.
