Glavna metoda posmatranja optičkog mikroskopa je posmatranje fluorescencije
Fenomen fluorescencije
Fluorescencija se odnosi na proces u kojem fluorescentna supstanca emituje svetlost veće talasne dužine skoro istovremeno kada je ozračena svetlošću određene talasne dužine (slika 1). Kada svjetlost određene talasne dužine (valne dužine ekscitacije) udari u molekul (kao što je molekul u fluoroforu), energiju fotona apsorbuju elektroni molekula. Zatim, elektroni prelaze iz osnovnog stanja (S0) u viši energetski nivo, pobuđeno stanje (S1'). Ovaj proces se naziva ekscitacija①. Elektron ostaje u pobuđenom stanju 10-9–10-8 sekundi, tokom kojih elektron gubi nešto energije ②. U procesu napuštanja pobuđenog stanja (S1) i vraćanja u osnovno stanje ③, preostala energija apsorbovana tokom procesa pobude će se osloboditi.
Vrijeme boravka fluorescentnog molekula u pobuđenom stanju je vijek trajanja fluorescencije, općenito u nanosekundama, što je inherentna karakteristika samog fluorescentnog molekula. Tehnologija snimanja koja koristi životni vijek fluorescencije naziva se Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), koja može izvesti dublja funkcionalna i preciznija mjerenja pored snimanja intenziteta fluorescencije kako bi se dobila molekularna konformacija, međumolekularne interakcije i molekularna mikrookruženja. informacije koje je teško dobiti konvencionalnim optičkim slikama.
Još jedno važno svojstvo fluorescencije je Stokesov pomak, razlika u talasnoj dužini između ekscitacije i emisionog vrha (slika 2). Obično je talasna dužina svetlosti emisije duža od talasne dužine pobuđene svetlosti. To je zato što nakon što je fluorescentna supstanca uzbuđena i prije nego što se foton oslobodi, elektroni će izgubiti dio energije kroz proces relaksacije. Fluorescentne supstance sa većim Stokesovim pomacima lakše je posmatrati pod fluorescentnim mikroskopom.
Fluorescencijski mikroskopi i blokovi fluorescentnih filtera
Fluorescentna mikroskopija je optički mikroskop koji koristi svojstva fluorescencije za posmatranje i snimanje, a široko se koristi u ćelijskoj biologiji, neurobiologiji, botanici, mikrobiologiji, patologiji, genetici i drugim poljima. Fluorescentno snimanje ima prednosti visoke osjetljivosti i visoke specifičnosti, te je vrlo pogodno za promatranje distribucije specifičnih proteina, organela itd. u tkivima i stanicama, proučavanje ko-lokalizacije i interakcije, te praćenje životne dinamike procesi kao što su promjene koncentracije jona.
Većina molekula u ćelijama ne fluorescira, a da bi ih vidjeli, moraju biti fluorescentno označeni. Postoje mnoge metode fluorescentnog obilježavanja, koje se mogu direktno označiti (kao što je korištenje DAPI-a za obilježavanje DNK), ili imunobojenje korištenjem svojstava antigena vezanja antitela, ili se ciljni protein može označiti fluorescentnim proteinima (kao što je GFP, zeleni fluorescentni protein) ili reverzibilno vezivanje. sintetičke boje (kao što je Fura-2), itd.
Trenutno je fluorescentni mikroskop postao standardna oprema za snimanje raznih laboratorija i platformi za snimanje i dobar je pomoćnik za naše svakodnevne eksperimente. Fluorescencijski mikroskopi se uglavnom dijele u tri kategorije: uspravni fluorescentni mikroskopi (prikladni za sečenje), invertirani fluorescentni mikroskopi (pogodni za žive ćelije, uzimajući u obzir preseke), fluorescentni stereoskopski mikroskopi (pogodni za veće uzorke, kao što su biljke, zebrice (odrasli/ embrion), medaka, organi miša/pacova, itd.).
Blok fluorescentnog filtera je osnovna komponenta fluorescentnog snimanja u mikroskopima. Sastoji se od ekscitacionog filtera, emisionog filtera i dikroičnog razdjelnika snopa. Instaliran je u točak filtera, kao što je Leica DMi8 opremljen sa 6-točkom filtera položaja (Slika 3). ). Različiti mikroskopi imaju različite položaje kotača, a neki mikroskopi koriste staklena stakla.
Filterski blok igra važnu ulogu u fluorescentnom snimanju: ekscitacioni filter bira ekscitaciono svetlo da pobuđuje uzorak i blokira druge talasne dužine svetlosti; svjetlost koja prolazi kroz ekscitacijski filter prolazi kroz dikroični razdjelnik snopa (njegova uloga je da reflektira pobuđujuću svjetlost i prenese fluorescenciju), nakon refleksije, fokusira se sočivom objektiva, ozrači se na uzorak, a odgovarajuća fluorescencija se pobuđuje na emituju svetlost. Emitovano svjetlo prikuplja objektiv objektiva, prolazi kroz dikroični razdjelnik snopa i dolazi do emisionog filtera. Kao što je prikazano na slici 4: talasna dužina ekscitacije je 450-490nm, dikroični razdjelnik snopa reflektira svjetlost kraću od 510nm, prenosi svjetlost dužu od 510nm, a opseg prijema emisionog svjetla je 520-560nm.
Fluorescencijski filteri koji se obično koriste u fluorescentnim mikroskopima mogu se podijeliti u dva tipa: dugopropusni (LP za kratko) i band pass (BP za kratko). Propusnost je obično određena centralnom talasnom dužinom i širinom intervala, kao što je 480/40, što znači da se svjetlost od 460-500nm može proći. Longpass filteri, kao što je 515 LP, propuštaju svjetlost s talasnim dužinama dužim od 515 nm (slika 5).
Fluorescentne supstance imaju svoju karakterističnu ekscitaciju (apsorpcionu) krivulju i emisionu krivulju, ekscitacioni vrh je idealna talasna dužina pobuđivanja (visoka efikasnost pobuđivanja, koja može smanjiti energiju pobuđivanja, štiti ćelije i boje), a kriva emisije je talasna dužina fluorescencije emisije. domet. Zbog toga ćemo u eksperimentu odabrati valnu dužinu što je moguće bližu ekscitacijskom vrhuncu za pobudu, a raspon prijema mora uključivati i emisioni vrh. Na primjer, ekscitacijski vrh Alexa Fluor 488 je 500nm, a ekscitacijski filter od 480/40 može se odabrati u fluorescentnom mikroskopu.
Detalji o filter kocki mogu se vidjeti u softveru za mikroskopsko snimanje. Razumijevanje boja i pronalaženje filtera koji najbolje odgovara vašem uzorku je ključno za fluorescentno snimanje. Spektralne informacije o fluorescentnim bojama i fluorescentnim proteinima općenito su navedene u uputama, a mogu se naći i na internetu.
Pored talasnih dužina ekscitacije i emisije fluorescentnih sondi, odabir blokova filtera takođe treba uzeti u obzir da li postoji nespecifična ekscitacija i da li postoji unakrsna boja za višebojno označene uzorke. Osim toga, potrebno je uzeti u obzir fluorescentni izvor svjetlosti koji se koristi. Trenutno, najčešće korišćeni fluorescentni izvori svetlosti uključuju živine lampe, metal-halogene lampe i LED izvore svetlosti koji su se brzo razvili poslednjih godina. Spektar fluorescentnog izvora svjetlosti je kontinuiran ili diskontinuiran, a energija će biti različita u različitim valnim dužinama. LED izvor svjetlosti postepeno postaje glavni izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa zbog svog relativno uskog spektralnog pojasa, stabilnijeg izlaza energije, dugog vijeka trajanja, sigurnije i zaštite okoliša i mnogih drugih prednosti.
Pored ugrađenog filterskog bloka mikroskopa, postoji i eksterni brzi kotač (slika 7). Brzina konverzije filtera pored eksternog brzog kotača Leica je 27 ms, što može da realizuje eksperimente velike brzine u više boja, kao što su FRET i Fura2 omjer kalcijuma. (Sl. 8) et al.
Širok izbor tehnika fluorescentne mikroskopije
Kako bi se zadovoljile različite potrebe fluorescentnog snimanja, osim fluorescentnih mikroskopa, razvijena su i različita rješenja za fluorescentno mikroskopsko snimanje:
Sistemi za snimanje slike visoke definicije širokog polja, kao što je Leica THUNDER Imager, koriste Leica-inu inovativnu Clearing tehnologiju za efikasno uklanjanje signala smetnji u nefokalnoj ravni tokom snimanja, predstavljajući jasne slike i prednosti snimanja velike brzine;
Konfokalni laserski skenirajući mikroskop koristi rupice za uklanjanje smetnji u nefokalnoj ravni, ostvaruje optičko sečenje i dobija slike visoke definicije i trodimenzionalne slike;
Mikroskopi ultra visoke rezolucije i nanomikroskopi koji probijaju granicu difrakcije mogu uočiti fine strukture manje od 200 nm;
Višefotonski sistem za snimanje koji koristi princip višefotonske ekscitacije za snimanje debelog tkiva i duboko in vivo;
Tehnologija snimanja lakih listova sa visokom vremenskom i prostornom rezolucijom, velikom brzinom snimanja, visokom rezolucijom, niskom fototoksičnošću, posebno pogodna za istraživanje razvoja i in vivo dinamičko posmatranje;
Fluorescentno snimanje životnog veka (FLIM), na koje ne utiču faktori kao što su koncentracija fluorescentne supstance, fotoizbeljivanje, intenzitet ekscitacionog svetla, itd., može da izvrši dublja funkcionalna i preciznija merenja;
Fluorescentna korelaciona spektroskopija (FCS) i fluorescentna unakrsna korelaciona spektroskopija (FCCS), mjere molekularni broj i koeficijent difuzije fluorescentnih molekula, analizirajući tako molekularnu koncentraciju, veličinu molekula, viskozitet, molekularno kretanje, molekularno vezivanje i svojstva molekularne disosocijacije;
Fluorescentna mikroskopija sa totalnom unutrašnjom refleksijom (TIRF), sa izuzetno visokom rezolucijom z-ose, idealna je za proučavanje molekularne strukture i dinamike površina ćelijskih membrana.
