Zašto nam je potrebna konfokalna mikroskopija?
1. Nakon napora i poboljšanja naših velikih prethodnika, optički mikroskop je dostigao savršen nivo. U stvari, obični mikroskopi nam mogu pružiti prekrasne mikroskopske slike jednostavno i brzo. Međutim, dogodio se događaj koji je donio revolucionarnu inovaciju u ovaj gotovo savršeni svijet mikroskopa, a to je izum "konfokalnog mikroskopa za lasersko skeniranje". Karakteristika ovog novog tipa mikroskopa je da usvaja optički sistem koji samo izdvaja informacije o slici na površini na kojoj je koncentrisan fokus. Promjenom fokusa i vraćanjem dobivenih informacija u memoriju slika, može dobiti živopisne slike s potpunom 3D informacijskom inteligencijom. Ovom metodom se lako mogu dobiti informacije o obliku površine koje se ne mogu potvrditi konvencionalnim mikroskopima. Pored toga, za tipične optičke mikroskope, "povećanje rezolucije" i "produbljivanje fokusne dubine" su kontradiktorni uslovi, posebno pri velikom uvećanju. Međutim, u konfokalnim mikroskopima ovaj se problem lako rješava.
2. Prednosti konfokalnih optičkih sistema
Konfokalni optički sistem se koristi za tačkasto osvetljenje uzorka, a reflektovanu svetlost prima i tačkasti senzor. Kada se uzorak postavi u fokusni položaj, skoro sva reflektovana svjetlost može doći do senzora. Kada uzorak odstupi od žarišne tačke, reflektovana svjetlost ne može doći do senzora. To znači da će u konfokalnom optičkom sistemu biti prikazana samo slika koja se poklapa sa fokusom, a tačka i beskorisno rasejano svetlo će biti zaštićeni.
Zašto koristiti laser?
U konfokalnim optičkim sistemima, tačkasto osvetljenje se primenjuje na uzorak, a reflektovanu svetlost takođe prima senzor tačke. Stoga su tačkasti izvori svjetlosti postali neophodni. Laser je vrlo tačan izvor svjetlosti. U većini slučajeva izvor svjetlosti konfokalne mikroskopije je laser. Osim toga, monokromatizam, usmjerenost i odličan oblik snopa lasera također su važni razlozi za njihovu široku primjenu.
4. Posmatranje u realnom vremenu zasnovano na skeniranju velike brzine postaje moguće
Lasersko skeniranje koristi akustični optički reflektor (AO) u horizontalnom smjeru i Servo Galvano ogledalo u vertikalnom smjeru. Zbog odsustva mehaničkih vibracija u audio optičkoj jedinici, moguće je izvršiti skeniranje velikom brzinom i posmatranje u realnom vremenu na ekranu za praćenje. Velika brzina ovog tipa kamere je veoma važan faktor koji direktno utiče na brzinu fokusiranja i pronalaženja pozicije.
5. Odnos između fokusnog položaja i svjetline
U konfokalnom optičkom sistemu, kada je uzorak pravilno postavljen u fokusnu poziciju, svjetlina je visoka, a svjetlina naglo opada prije i poslije njega (puna linija na slici 4). Osjetljiva selektivnost ove fokalne ravni je upravo princip koji stoji iza određivanja smjera visine i proširenja fokalne dubine u konfokalnoj mikroskopiji. U poređenju s tim, tipični optički mikroskopi ne pokazuju značajne promjene svjetline prije i poslije fokusnog položaja (isprekidana linija na slici 4).
6. Visok kontrast i rezolucija
Tipičan optički mikroskop, zbog interferencije uzrokovane reflektiranom svjetlošću koja odstupa od žarišne točke, preklapa se sa žarišnim dijelom za snimanje, što rezultira smanjenjem kontrasta slike. Nasuprot tome, u konfokalnim optičkim sistemima, raspršena svjetlost izvan fokusa i raspršena svjetlost unutar sočiva objektiva se gotovo u potpunosti uklanjaju, čime se dobijaju slike s vrlo visokim kontrastom. Osim toga, zbog činjenice da svjetlost dva puta prolazi kroz sočivo objektiva, tačkasta slika prvo postaje oštrija, što također poboljšava rezoluciju mikroskopa.
