Tehnike bojenja i mikroskopsko posmatranje mikroorganizama
1. Svrha
1.1 Naučite osnovne tehnike mikrobnih razmaza i bojenja.
1.2 Savladajte jednostavnu metodu bojenja bakterija.
1.3 Preliminarno razumjeti morfološke karakteristike bakterija i konsolidirati znanje o korištenju uljnih sočiva i tehnikama aseptičnog rada.
2 Principi
Razmazivanje i bojenje bakterija je osnovna tehnika u mikrobiološkim eksperimentima. Bakterijske ćelije su male i prozirne, što ih čini teškim za identifikaciju pod običnim svjetlosnim mikroskopom; moraju biti obojene. Jedna boja se koristi za bojenje bakterija, tako da obojene bakterije formiraju jasnu razliku u boji u odnosu na pozadinu, tako da se njihova morfologija i struktura mogu jasnije uočiti. Ova metoda je laka za rukovanje i pogodna je za promatranje općeg oblika bakterijskih stanica i rasporeda bakterija. Osnovne boje se obično koriste za jednostavno bojenje. To je zato što su u neutralnim, alkalnim ili slabo kiselim otopinama bakterijske stanice obično negativno nabijene, a kada su bazične boje ionizirane, dio njihovih molekula za bojenje je pozitivno nabijen, pa su one alkalne. Dio boje za bojenje lako se kombinira s bakterijama kako bi ih obojio. Obojene bakterijske ćelije su u oštrom kontrastu s pozadinom, što ih čini lakšim za identifikaciju pod mikroskopom. Boje koje se obično koriste za jednostavno bojenje uključuju metilensko plavo, kristalno ljubičasto, bazični fuksin, itd. Kada bakterije razgrađuju šećere i proizvode kiselinu, uzrokujući pad pH medija kulture, pozitivni naboj na bakterijama se povećava. U ovom trenutku, kisele boje kao što su eozin, kiseli fuksin ili Kongo crveno mogu se koristiti za bojenje. Bakterije se moraju fiksirati prije bojenja. Ima dvije svrhe: jedna je da ubije bakterije i učini ih da se zalijepe za staklo; drugi je povećati njihov afinitet prema bojama. Dvije najčešće korištene metode su zagrijavanje i kemijska fiksacija. Prilikom fiksiranja pokušajte zadržati izvorni oblik ćelija.
3 materijala
3.1 Bakterije: Bacillus subtilis 12-18h hranljiva agar kultura, Staphylococcus aureus 24h hranljiva agar kultura, Escherichia coli 24h hranljiva agar kultura, kosi agar agar pekarskog kvasca.
3.2 Sredstvo za bojenje: Lu-ova alkalna metilen plava boja (ili amonijum oksalat kristalno ljubičasta boja), karbonska kiselina fuksin boja.
3.3 Instrumenti ili drugi pribor: mikroskop, alkoholna lampa, predmetno staklo, omča za inokulaciju, stalak za stakalce, dvoslojna boca (koja sadrži kedrovo ulje i ksilen), tkivo za sočiva, fiziološki rastvor ili destilovana voda, itd.
4. Proces: razmazivanje → sušenje → fiksiranje → bojenje → pranje → sušenje → mikroskopski pregled.
5 koraka
5.1 Razmazivanje: Uzmite dva čista staklena pločica bez ulja. U sterilnim uslovima, stavite malu kap fiziološkog rastvora (ili destilovane vode) na svaki centar stakalca. Upotrijebite petlju za inokulaciju da sterilizirate bakterije iz Bacillus subtilisa. , Micrococcus luteus i Escherichia coli, pokupite malo bakterijskog travnjaka u kapljicama vode na kosi, dobro promiješajte i nanesite u tanki film. Ako koristite razmaz bakterijske suspenzije (ili tečne kulture), možete koristiti petlju za inokulaciju da odaberete 2 do 3 petlje i nanesete ih direktno na stakalce. Pazite da ne ispustite previše fiziološke otopine (destilirane vode) i uklonite bakterije i nanesite je ravnomjerno i ne previše gusto.
5.2 Sušenje Osušite prirodno na sobnoj temperaturi. Možete ga i lagano zagrijati iznad alkoholne lampe sa premazanom stranom okrenutom prema gore da se osuši. Ali pazite da se ne približite previše plamenu, jer će previsoka temperatura uništiti morfologiju bakterija.
5.3 Fiksacija Ako se koristi zagrijano sušenje, fiksacija i sušenje se kombinuju u jedan korak, a metoda je ista kao i sušenje. Razmazati, osušiti i zagrijati.
5.4 Bojenje: Stavite stakalcu ravno na stalak za stakalce i dodajte 1 do 2 kapi rastvora boje na razmaz (prikladno je da rastvor boje samo prekrije film za razmazivanje). Bojite Lu-ovim baznim metilen plavim 1 do 2 minute i bojite fuksinom karbonske kiseline (ili kristalno ljubičastom amonijum oksalatom) oko 1 minut.
5.5 Pranje vodom: Odlijte rastvor boje i nežno isperite vodom iz česme sa jednog kraja stakalca sve dok voda koja teče iz mrlje ne postane bezbojna. Kada perete vodom, ne perite premazanu površinu direktno vodom. Protok vode ne bi trebao biti prebrz ili prevelik kako bi se spriječilo opadanje razmazanog filma.
5.6 Sušenje: Otresite kapljice vode na stakalcu i osušite prirodnim putem, osušite fenom ili upijajte upijajućim papirom (pazite da ne obrišete bakterije). 5.7 Mikroskopski pregled Nakon što se razmaz osuši, izvršite mikroskopski pregled. Razmaz mora biti potpuno suh prije gledanja uljnim sočivom.
6 Rezultati Nacrtajte morfologiju E. coli i Micrococcus luteus uočene nakon jednog bojenja.
