Radno poznavanje konfokalne fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip konfokalne fluorescentne mikroskopije: Koristite tačkasti izvor svetlosti da biste osvetlili uzorak da biste formirali malu, dobro definisanu svetlosnu tačku na fokalnoj ravni. Fluorescencija koju emituje tačka nakon osvjetljenja sakuplja se sočivom objektiva i vraća se u dihroično ogledalo duž izvorne putanje svjetlosti osvjetljenja. čine razdjelnik zraka. Spektrometar šalje fluorescenciju direktno na detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, koji se nazivaju rupica za osvjetljenje i rupica za detekciju. Geometrijske dimenzije ova dva su konzistentne, oko 100-200nm; u odnosu na svjetlosnu tačku na fokalnoj ravni, dvije su konjugirane, to jest, svjetlosna tačka prolazi kroz niz sočiva i na kraju može biti fokusirana na otvor za osvjetljenje i rupicu za detekciju u isto vrijeme. Na ovaj način, svjetlost iz žarišne ravni može biti koncentrisana unutar dometa detekcijske rupe, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod fokalne ravni blokirana izvan otvora za detekciju i ne može se snimiti. Uzorak se skenira tačku po tačku laserom, a fotomultiplikatorska cijev iza rupice za detekciju također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke tačku po tačku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na kompjuter, i konačno agregira na ekran u jasnu konfokalnu sliku cijele fokalne ravni. .
Svaka slika u fokalnoj ravni je zapravo optički poprečni presjek uzorka. Ovaj optički poprečni presek uvek ima određenu debljinu i naziva se i optički tanak presek. Budući da je intenzitet svjetlosti u fokusu mnogo veći od intenziteta svjetlosti u nefokusu, a svjetlost u nefokalnoj ravni filtrira rupicu, dubina polja konfokalnog sistema je približno nula. Skeniranjem duž pravca Z-ose može se realizovati optička tomografija, formirajući željeni. Posmatrajte dvodimenzionalni optički presek na fokusiranoj tački uzorka. Kombinovanjem skeniranja u ravni XY (fokalna ravan) sa skeniranjem po Z-osi (optička osa), akumulacijom kontinuiranih nivoa dvodimenzionalnih slika i njihovom obradom specijalizovanim kompjuterskim softverom, može se dobiti trodimenzionalna slika uzorka.
To jest, rupica za detekciju i rupica izvora svjetlosti su uvijek fokusirani na istu tačku, tako da fluorescencija pobuđena izvan fokusne ravni ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserskog konfokalnog je da koristi laser kao izvor svjetlosti. Na osnovu tradicionalnog fluorescentnog mikroskopskog snimanja, dodaju se uređaj za lasersko skeniranje i uređaj za konjugirano fokusiranje, a sustavom upravlja kompjuter za prikupljanje i obradu digitalnih slika.
