Prednosti i nedostaci višefotonske laserske skenirajuće mikroskopije
Višefotonska laserska skenirajuća mikroskopija je eksperimentalna metoda zasnovana na tehnologiji laserske skenirajuće mikroskopije, koja pruža preciznije mogućnosti optičkog sečenja u trodimenzionalnom posmatranju. Metoda multifotonske ekscitacije fluorescencije koristi dugovalnu crvenu svjetlost ili blisku infracrvenu svjetlost za prikupljanje fluorescentnih slika visoke rezolucije uzoraka, što ima minimalno oštećenje živih uzoraka, pa je pogodno za snimanje živih ćelija, posebno za debela živa tkiva kao što je npr. moždane kriške, embrioni, slikovne studije cijelih organa ili čak cijelih organizama.
Prednosti su sljedeće:
1. Pobuđen crvenim ili infracrvenim svjetlom, raspršivanje svjetlosti je malo (rasipanje malih čestica je obrnuto proporcionalno četvrtom stepenu talasne dužine).
2. Nema potrebe za rupicama i može se prikupiti više rasutih fotona iz sekcije za snimanje.
3. Pinhole ne može razlikovati raspršene fotone emitirane iz područja izvan fokusa ili područja fokusa, a omjer signala i šuma višefotonskog snimanja u dubokim slojevima je dobar.
4. Ultraljubičasto ili vidljivo svjetlo koje se koristi za jednofotonsko pobuđivanje lako se apsorbira i prigušuje od strane uzorka prije nego snop stigne do žarišne ravni, a nije lako pobuditi duboke slojeve.
5. U smislu posmatranja biološkog mikroskopa, prva pažnja je da se ne ošteti aktivno stanje samog organizma i da se održi cirkulacija vode, koncentracije jona, kiseonika i hranljivih materija. U slučaju promatranja svjetlosti, i toplina i energija fotona moraju ostati unutar količine zračenja i svjetlosne energije koja neće oštetiti ćelije.
6. Multifotonska mikroskopija također ima mnoge prednosti. Kao što su trodimenzionalna rezolucija, duboka penetracija, efikasnost raspršenja, pozadinsko svjetlo, omjer signala i šuma, kontrola, itd., postoje superiorne karakteristike koje laserski mikroskopi nemaju ili su ih imali neuporedive u prošlosti.
Višefotonska konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija proširena je na različita polja istraživanja i primjene. Može da vrši trodimenzionalno nedestruktivno posmatranje uzoraka u prirodnom stanju i može da poboljša rezoluciju i odnos signal-šum sistema. Koristeći višefotonske ekscitacione materijale. Takođe može realizovati trodimenzionalno skladištenje podataka o visini i trodimenzionalnu mikrofabrikaciju proizvoljnog pravca, koja ima veliku primenu. Vjeruje se da će daljnjim razvojem strojeva, materijala i laserske tehnologije vezanih za multifotonsku konfokalnu mikroskopiju, sve više fotonskih konfokalnih laserskih skenirajućih mikroskopa dobiti veći razvoj i širu primjenu.
Nedostaci su sljedeći:
1. Samo za fluorescentno snimanje.
2. Ako uzorak sadrži hromofore koji mogu apsorbirati ekscitacijsko svjetlo, kao što su pigmenti, uzorak može biti termički oštećen.
3. Rezolucija je malo smanjena. Iako se može poboljšati korištenjem konfokalnog otvora u isto vrijeme, signal će se izgubiti.
4. Zbog ograničenja skupih ultrabrzih lasera, cijena višefotonskog skenirajućeg mikroskopa je relativno visoka.
