Primjena koncepta modernog mikroskopa u posmatranju mikroskopskog svijeta
Od davnina do danas, ljudska bića su tragala za višim i daljim istinama. Od okeanskih putovanja do istraživanja svemira, ljudi su jedan za drugim osvajali velike ciljeve. Međutim, makroskopski svijet koji ljudi vide golim okom nije cijeli svijet, a ljudsko oko ga ne može jasno vidjeti. Takođe privlači bezbroj ljudi da istražuju i traže.
Bez obzira na makroskopske ili mikroskopske stvari, naša zapažanja se zasnivaju na atributima trodimenzionalnog prostora, odnosno XYZ trodimenzionalnog, a za posmatranje promjena oblika stvari potrebno je uvesti još jedan faktor mjerenja – vrijeme T, pa je najkompletniji način posmatranja stvari mora biti Istovremeno snimanje XYZT-a, odnosno dugoročno fotografisanje oblika i vremena, takođe je krajnja funkcija mikroskopa.
Nakon više od 300 godina razvoja, moderni mikroskopi su predložili koncepte kao što su rezolucija, dubina polja i vidno polje, i kontinuirano su predlagali rješenja. Mikroskopi su u početku zadovoljili naše potrebe za promatranjem mikroskopskog svijeta i pomogli nam da snimimo prostor i vrijeme mikroskopskog svijeta.
Najvažnija stvar u posmatranju mikroskopskog svijeta je razlučivanje detalja, a iz toga je rođen koncept rezolucije. Rezolucija se odnosi na minimalnu udaljenost između dvije točke koju ljudsko oko može razlikovati, a vrijedi samo u XY dimenziji. Prema Rayleighovom kriteriju, Rayleighovom kriteriju, granica koju normalni ljudi mogu razlikovati je dvije tačke od 0.2mm na udaljenosti od 25 cm. Kada koristimo mikroskop, možemo vidjeti dvije točke na manjoj udaljenosti, što poboljšava rezoluciju našeg promatranja. Uz kontinuirano produbljivanje modernih istraživanja, zahtjevi ljudi za rezolucijom također se stalno povećavaju, a naučnici također konstantno poboljšavaju rezoluciju mikroskopa. Na primjer, elektronski mikroskopi su povećali rezoluciju na nanometarski nivo, omogućavajući promatranje virusa. Ultra-visoka tehnologija mikroskopskog snimanja poboljšava rezoluciju mikroskopa sa 200 nanometara na desetine nanometara, ostvarujući posmatranje organela živih ćelija.
Poboljšanje rezolucije donosi i nove probleme, odnosno smanjenje vidnog polja i dubine polja. Kada se koristi obična metoda centralnog osvjetljenja (metoda fotopičkog osvjetljenja koja čini da svjetlost ravnomjerno prolazi kroz uzorak), rezolucijska udaljenost mikroskopa je d=0.61 λ/NA, opseg talasnih dužina vidljive svjetlosti je { {2}}nm, prosječna talasna dužina je 550 nm, a talasna dužina je fiksna konstanta. Stoga, povećanjem NA vrijednosti može se dobiti manja vrijednost D, odnosno udaljenost između dvije tačke koje se mogu razlikovati Manji, omogućavajući ljudima da jasno vide manje objekte.
NA vrijednost je numerički otvor, koji opisuje veličinu konusnog ugla objektiva koji prima svjetlost, NA=n * sin , odnosno proizvod indeksa prelamanja (n) medija između sočiva i predmet koji treba pregledati i sinus polovine ugla otvora blende (2). n je indeks loma svjetlosti medija između sočiva objektiva i uzorka. Kada je medij prostornog prostora mikroskopa zrak, indeks prelamanja n=1. Korištenje medija s većim indeksom prelamanja od zraka može značajno povećati NA vrijednost. Medijum za uranjanje u vodu je destilovana voda, a indeks loma je 1,33; medij za objektiv za uranjanje u ulje je kedrovo ulje ili druga prozirna ulja, a njegov indeks loma je općenito oko 1,52, što je blizu indeksu prelamanja sočiva i stakla. Stoga je NA vrijednost uljnog sočiva viša od one zračne leće.
Ugao otvora blende, takođe poznat kao "ugao ušća ogledala", je ugao koji formira tačka objekta na optičkoj osi sočiva i efektivni prečnik prednjeg sočiva objektiva. Povećanje ugla ušća ogledala može povećati vrijednost sinusa, a njegova stvarna gornja granica je oko 72 stepena (vrijednost sinusa je 0.95), pomnoženo indeksom prelamanja kedrovog ulja 1,52, može se dobiti da maksimalna NA vrijednost je oko 1,45, a ako se zameni u formulu za izračunavanje rezolucije, može se dobiti da je granična rezolucija ravni XY konvencionalnog mikroskopa oko 0.2um.
NA vrijednost također direktno utiče na svjetlinu vidnog polja mikroskopa (B). Iz formule B∝NA2/M2 možemo zaključiti da se svjetlina povećava s povećanjem numeričke blende (NA) ili smanjenjem uvećanja objektiva (M).
Teoretski, trebali bismo težiti najvišoj mogućoj vrijednosti NA da bismo dobili bolju rezoluciju XY ravni i svjetlinu vidnog polja. Međutim, sve ima dvije strane. Poboljšanje rezolucije XY ravni će smanjiti dubinu polja Z-ose i vidno polje za posmatranje.
Mikroskopi općenito gledaju pogled okomito prema dolje. Kada se konveksna pozicija i konkavna pozicija na površini objekta posmatrana unutar prečnika vidnog polja mogu jasno vidjeti, tada je visinska razlika između konveksne i konkavne točke dubina polja. Pa, za mikroskope, što je veća dubina polja, to bolje. Što je veća dubina polja, to se bolje i jasnije trodimenzionalne slike mogu dobiti kada se posmatra površina neravnih objekata. Velika dubina polja pomaže nam da mikroskopski svijet promatramo u vertikalnom smjeru. To jest, informacije o Z-osi u XYZ trodimenzionalnom obliku.
Dubina polja je dubina prednjeg i stražnjeg prostora koja odgovara jasnoj slici na ravni slike: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M∗NA) * e, dtot: dubina polja , NA: numerički otvor, M: ukupno povećanje, λ: talasna dužina svjetlosti, (obično λ=0.55um), n: indeks prelamanja medija između uzorka i sočiva objektiva (vazduh: n{{3 }}, ulje: n=1.52) Prema ovoj formuli, možemo znati da je dubina polja Z ose obrnuto proporcionalna NA vrijednosti XY ravni.
Osim dubine polja, na vidno polje utiče i NA vrijednost. Prostorni raspon koji se može vidjeti kada instrument fiksirano gleda u tačku je vidno polje. Njegov proračun je direktno povezan sa uvećanjem objektiva. Stvarni prečnik vidnog polja viđenog posmatranjem jednak je prečniku vidnog polja Podeljeno povećanjem sočiva objektiva, okular će pokazati odgovarajuće vidno polje, kao što je 10/18, tj. uvećanje je 10 puta, a prečnik vidnog polja je 18 mm. Stoga, kada se odredi okular, što je veće povećanje, to je manje posmatrano vidno polje.
Rezolucija u ravni XY je analiza lokalnih detalja, a vidno polje određuje naš opseg posmatranja uzorka. Što je veće vidno polje, to bolje, ali ograničeno trenutnom tehnologijom, moramo koristiti sočiva objektiva velike snage da bismo dobili dobre NA vrijednosti, stoga, vrijednosti vidnog polja i NA imaju indirektnu negativnu korelaciju.
