Osnovna struktura konfokalne fluorescentne mikroskopije
(1) Modul za skeniranje
Modul za skeniranje se uglavnom sastoji od pinhole svjetlosne trake (kontrolira debljinu optičkih isječaka), spektroskopa (koji mijenja smjer širenja svjetlosti prema talasnoj dužini), emisionog fluorescentnog kolorimetra (odabir svjetlosti unutar određenog raspona valnih dužina za detekciju) i detektor (fotomultiplikator). Mješovita fluorescencija u fluorescentnom uzorku ulazi u skener, a nakon odabira svjetlosnom trakom za detekciju pinhole, spektrometrom i kolorimetrom, dijeli se na različite monokromatske fluorescencije, koje se detektuju u različitim fluorescentnim kanalima i formiraju odgovarajuće konfokalne slike. Istovremeno, nekoliko paralelnih monohromatskih fluorescentnih slika i njihovih kompozitnih slika može se prikazati na ekranu računara.
(2) Fluorescentni mikroskopski sistem
Mikroskop je glavna komponenta LSCM-a, koja se odnosi na kvalitet slike sistema. Optička staza mikroskopa može se lako umetnuti u beskonačno udaljen optički sistem sa optičkim opcijama bez uticaja na kvalitet slike i tačnost merenja. Objektiv bi trebao biti apohromatski objektiv s ravnim poljem s velikom numeričkom aperturom, koji je koristan za akviziciju fluorescencije i jasnu sliku. Konverzija grupe sočiva objektiva, izbor grupe filtera u boji, podešavanje pokreta pozornice i zaključavanje žižne ravni memorije sve bi trebalo automatski da kontroliše računar.
Fluorescencijski mikroskop koji se koristi u laserskoj skenirajućoj konfokalnoj mikroskopiji općenito je isti kao i konvencionalni fluorescentni mikroskop, ali ima svoje karakteristike: potrebno ga je povezati sa skenerom, tako da laser može ući u cilj mikroskopa kako bi ozračio uzorak i napravio fluorescencija koju emituje uzorak dospeva do detektora; Potreban je uređaj za konverziju putanje svetlosti, koji pretvara živine lampe u lasere, a intenzitet svetlosti živine lampe se može podesiti.
(3) Uobičajeni laseri
Laserski izvori koji se koriste u laserskoj skenirajućoj konfokalnoj mikroskopiji uključuju pojedinačne laserske i više laserske sisteme, a najčešće korišteni laseri uključuju sljedeće tri vrste:
Poluprovodnički laser: 405nm (blizu ultraljubičaste spektralne linije)
Argon jonski laser: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (plavo zeleno svjetlo)
He-Ne laser: 543nm (zeleno svjetlo He-Ne zeleni laser) 633nm (crveno svjetlo He-Ne crveni laser)
UV laser (UV laser): 351 nm, 364 nm (UV svjetlo)
(4) Pomoćna oprema
Vazdušno hlađeni, vodeno hlađeni sistemi hlađenja i regulisana napajanja.
Osnovni princip rada laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa je da prvo emituje određenu talasnu dužinu ekscitacionog svetla iz lasera. Nakon pojačanja, svjetlost prolazi kroz osvijetljenu svjetlosnu traku s rupicama u skeneru kako bi formirala tačkasti izvor svjetlosti. Objektiv se fokusira na fokalnu ravan uzorka, a odgovarajuće osvijetljene tačke na uzorku se pobuđuju i emituju fluorescenciju. Nakon što prođe kroz svjetlosnu traku otvora za detekciju, dolazi do detektora i prikazuje se na monitorskom ekranu računara. Na taj način se fluorescentnim slikama svake tačke uzorka na fokalnoj ravni formira potpuna konfokalna slika, koja se naziva svjetlosni srez.
