Određivanje broja mikroorganizama - metoda direktnog brojanja mikroskopom!
Rast populacije bakterija se manifestuje povećanjem broja ćelija ili povećanjem ćelijske mase. Metode za određivanje broja ćelija uključuju metodu direktnog brojanja mikroskopom, metodu brojanja kolonija na ploči, metodu omjera fotoelektričnog ulja, metodu maksimalne vjerovatnoće i metodu membranske filtracije. Metode mjerenja ćelijske materije uključuju određivanje suhe težine ćelije, određivanje određenih ćelijskih komponenti kao što su sadržaj dušika, RNK i DNK, te određivanje metabolita. Ukratko, postoji mnogo metoda za mjerenje rasta mikroorganizama, od kojih svaka ima svoje prednosti i nedostatke i treba ih odabrati u skladu sa specifičnom situacijom. Ovaj eksperiment uglavnom uvodi mikroskopsku metodu direktnog brojanja koja se obično koristi u proizvodnji i naučnim istraživanjima.
1. Zahtjevi za svrhu
1. Pojasniti princip broja krvnih zrnaca.
2. Savladajte metodu brojanja mikroorganizama pomoću brojača krvnih zrnaca.
2. Osnovni principi
Metoda direktnog brojanja mikroskopom je jednostavna, brza i intuitivna metoda za direktno prebrojavanje male količine suspenzije uzorka koji se testira na posebnom staklenom predmetu određene površine i volumena (također poznat kao brojač bakterija). Metode. Trenutno se najčešće koriste brojači bakterija u zemlji i inostranstvu: ploča za brojanje krvnih zrnaca, Peteroff-Hauser brojač bakterija i Hawksley brojač bakterija, itd. Mogu se koristiti za brojanje kvasca, bakterija, spora plijesni i drugih suspenzija, i osnovni princip je isti. Posljednje dvije vrste brojača bakterija imaju ukupnu zapreminu od 0.02mm3 nakon što su prekrivene pokrovnim staklom, a razmak između pokrovnog stakla i klizača je samo 0,02 mm, tako da ulje Imerziona sočiva objektiva mogu se koristiti za promatranje i promatranje malih ćelija kao što su bakterije. count. Osim ovih bakteriometara, postoji i metoda procjene odnosa površine razmaza prema površini vidnog polja koja se posmatra direktno pod mikroskopom, koja se uglavnom koristi za bakteriološko ispitivanje mlijeka. Prednosti mikroskopske metode direktnog brojanja su intuitivne, brze i jednostavne za rukovanje. Međutim, nedostatak ove metode je što je izmjereni rezultat obično zbir mrtvih i živih ćelija. Trenutno postoje neke metode za prevazilaženje ovog nedostatka, kao što je kombinacija kulture mikrokomora bojenja živih bakterija (kratko vrijeme) i dodavanje inhibitora stanične diobe kako bi se postigla svrha brojanja samo živih bakterija.
U ovom eksperimentu, hemocitometar je korišten kao primjer za direktno mikroskopsko brojanje. Za korištenje druge dvije vrste brojača bakterija, pogledajte upute svakog proizvođača. Brojanje direktno pod mikroskopom pomoću hemocitometra je uobičajena metoda za brojanje mikroorganizama. Ploča za brojanje je poseban stakleni tobogan, na kojem su tri platforme formirane sa četiri proreza; šira platforma u sredini je kratkim poprečnim prorezom podijeljena na dvije polovine, a sa svake strane platforme je mreža. Svaka mreža je podijeljena na devet velikih kvadrata, a veliki kvadrat u sredini je soba za brojanje. Struktura ploče za brojanje krvnih zrnaca prikazana je na slici l{{{{10}}}}. Skala sobe za brojanje općenito ima dvije specifikacije, jedna je veliki kvadrat podijeljen na 25 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 16 malih kvadrata (slika 15-2); drugi je veliki kvadrat. Kvadrat je podijeljen na 16 srednjih kvadrata, a svaki srednji kvadrat je podijeljen na 25 malih kvadrata, ali bez obzira na vrstu ploče za brojanje, u svakom velikom kvadratu ima 400 malih kvadrata. Dužina stranice svakog velikog kvadrata je 1 mm, a površina svakog velikog kvadrata je 1 mm2. Nakon prekrivanja pokrivnim staklom, visina između pokrovnog stakla i kliznog stakla je 0,1 mm, tako da je zapremina komore za brojanje 0,lmm3 (hiljaditi dio mililitra). Slika 15-1 Struktura ploče za brojanje krvnih zrnaca (1) Slika 15-2 Struktura ploče za brojanje krvnih zrnaca (2) A. Pogled sprijeda; B. Pogled na uzdužni presjek; Uvećana mreža, veliki kvadrat u sredini je komora za brojanje 1. Krvne ćelije Ploča za brojanje; 2. Poklopno staklo; 3. Kada brojite u komori za brojanje, obično izbrojite ukupan broj bakterija u pet kvadrata, zatim izračunajte prosjek svakog kvadrata i pomnožite sa 25 ili 16 da dobijete Ukupan broj bakterija u velikom kvadratu se zatim pretvara u ukupan broj bakterija u 1 ml bakterijske otopine. Neka ukupan broj bakterija u pet kvadrata bude A, a omjer razrjeđenja bakterijske otopine B. Ako je to ploča za brojanje sa 25 kvadrata, ukupan broj bakterija u 1 mL bakterijske otopine {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(komada) Slično, ako je ploča za brojanje sa 16 srednjih kvadrata, ukupan broj bakterija u 1mL bakterijskog rastvora=A/ 5×16×104×B=32000A·B (komada)
3. Oprema
1. Bakterije
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenti ili drugi pribor
Hemocitometar, mikroskop, pokrovno staklo, sterilna kapilarna kapaljka.
4. Operativni koraci
1. Priprema bakterijske suspenzije
Saccharomyces cerevisiae pripremljen je u bakterijsku suspenziju odgovarajuće koncentracije sa sterilnom fiziološkom otopinom.
2. Prostorija za brojanje mikroskopa
Prije dodavanja uzoraka, mikroskopski pregledajte komoru za brojanje ploče za brojanje. Ako ima prljavštine, potrebno je očistiti i osušiti prije brojanja.
3. Dodajte uzorak
Čisti i suhi hemocitometar prekrijte pokrovnim stakalcem, a zatim sterilnom kapilarnom kapaljkom ukapajte malu kap promućkane suspenzije Saccharomyces cerevisiae s ruba pokrovnog stakla i pustite da se bakterijska otopina automatski kreće duž otvora kapilarnom osmozom. Ulaskom u prostoriju za brojanje, opća soba za brojanje može se napuniti bakterijskom tekućinom. Prilikom uzorkovanja, prvo protresite bakterijsku otopinu; prilikom dodavanja uzoraka, u komori za brojanje ne bi se trebali stvarati mjehurići zraka.
4. Brojanje mikroskopom
Nakon dodavanja uzorka, ostanite mirno 5 minuta, a zatim postavite hemocitometar na mikroskopski stub, prvo pronađite lokaciju komore za brojanje pomoću mikroskopa male snage, a zatim prijeđite na mikroskop velike snage za brojanje. Na odgovarajući način podesite intenzitet svjetla mikroskopa. Kod mikroskopa koji koriste ogledala za osvjetljenje, pazite da ne odstupite s jedne strane svjetla, inače neće biti lako u vidnom polju jasno vidjeti kvadratne linije sobe za brojanje, ili će samo okomite ili horizontalne linije biti viđen. Ako se utvrdi da je bakterijska otopina previše koncentrirana ili previše razrijeđena prije brojanja, potrebno je ponovno podesiti razrjeđenje prije brojanja. Generalno, za razrjeđivanje uzorka potrebno je oko 5 do 10 bakterija u svakoj maloj ćeliji. Svaka komora za brojanje bira 5 srednjih ćelija (opciono 4 ugla i jedna srednja ćelija u centru) za brojanje. Ćelije koje se nalaze na liniji mreže obično se broje samo na gornjoj i desnoj liniji. U slučaju pupanja kvasca, kada veličina pupoljka dostigne polovinu matične ćelije, računa se kao dvije bakterijske ćelije. Da biste prebrojali uzorak, izračunajte sadržaj bakterija u uzorku tako što ćete izračunati prosječnu vrijednost iz dvije komore za brojanje.
5. Operite broj krvnih zrnaca
Nakon upotrebe, isperite ploču za brojanje krvnih zrnaca vodom iz slavine, nemojte je trljati tvrdim predmetima i osušite je sami ili sušilom za kosu nakon pranja. Mikroskopski pregled kako bi se utvrdilo da li u svakoj maloj ćeliji ima zaostalih bakterija ili drugih sedimenata. Ako nije čist, mora se više puta prati dok ne bude čist.
