Razlika između fluorescentnog mikroskopa i normalnog mikroskopa
Nedavno sam pokušao napraviti neke zamrznute dijelove miševa. Zatim ću koristiti fluorescentni mikroskop da vidim da li je virus koji sam ubrizgao u područje mozga koje želim. Neke osnovne principe fluorescentne mikroskopije treba ukratko naučiti, a ja ću ih ovdje podijeliti.
Fluorescentni mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti za osvjetljavanje objekta koji se pregledava, uzrokujući da predmet emituje svjetlost, a zatim promatra predmet pod mikroskopom. Uglavnom se koristi za imunofluorescentne ćelije. Uglavnom se sastoji od izvora svjetlosti, sistema filterskih ploča i optičkog sistema. Fluorescentna slika uzorka se posmatra kroz uvećanje okulara i objektiva. Pogledajmo razliku između fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa.
1. Pogledajte način osvjetljenja
Metoda osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa je općenito epi-iluminacija, što znači da se izvor svjetlosti postavlja na ispitni uzorak kroz objektiv objektiva.
2. Pogledajte rezoluciju
Fluorescencijski mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti, koje ima kraću valnu dužinu, ali veću rezoluciju od običnih optičkih mikroskopa.
3. Razlike u filterima
Fluorescencijski mikroskopi koriste dva posebna filtera, jedan se koristi ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a drugi se koristi između objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastih zraka, koji mogu zaštititi ljudske oči.
Fluorescencijski mikroskop je također vrsta optičkog mikroskopa. Glavni razlog je taj što je talasna dužina koju pobuđuje fluorescentni mikroskop kratka, pa to dovodi do razlike u strukturi i upotrebi između fluorescentnog mikroskopa i običnog mikroskopa. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabe svjetlosti. , tako da je njegova sposobnost snimanja dobra i pod izuzetno slabom fluorescencijom. Zajedno sa kontinuiranim poboljšanjem fluorescentnih mikroskopa posljednjih godina, buka je također uvelike smanjena. Stoga se sve više koristi fluorescentni mikroskopi.
Poznavanje dvofotonske fluorescentne mikroskopije
Osnovni princip dvofotonske ekscitacije je: pod uslovima velike gustine fotona, fluorescentne molekule mogu istovremeno apsorbovati dva fotona duge talasne dužine, a nakon kratkog života u takozvanom pobuđenom stanju, emituju foton kraće talasne dužine. . ;Efekat je isti kao da koristite foton sa talasnom dužinom upola manjom od duge talasne dužine za pobuđivanje fluorescentnih molekula. Dvofotonsko pobuđivanje zahtijeva veliku gustinu fotona. Kako ne bi oštetili ćelije, dvofotonski mikroskopi koriste pulsne lasere visoke energije sa zaključavanjem moda. Ovaj laser emituje lasersko svetlo sa visokom vršnom energijom i niskom prosečnom energijom, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom od 80 do 100 MHz. Kada se za fokusiranje fotona pulsirajućeg lasera koristi objektiv objektiva s velikim numeričkim otvorom, gustina fotona u fokusu sočiva objektiva je najveća. Dvofotonska ekscitacija se javlja samo u fokusu sočiva objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalnu rupicu, što poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije.
U općenitom fenomenu fluorescencije, zbog niske gustine fotona ekscitacijske svjetlosti, fluorescentna molekula može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitovati jedan fluorescentni foton kroz radijacioni prijelaz. Ovo je jednofotonska fluorescencija. Za proces pobuđivanja fluorescencije koristeći laser kao izvor svjetlosti, mogu se pojaviti dvofotonski ili čak višefotonski fenomeni fluorescencije. U ovom slučaju, intenzitet ekscitacionog izvora svjetlosti koji se koristi je visok, a gustina fotona zadovoljava zahtjev da fluorescentni molekuli apsorbuju dva fotona u isto vrijeme. U procesu korištenja običnih lasera kao izvora pobuđivačkog svjetla, gustina fotona još uvijek nije dovoljna da proizvede dvofotonsku apsorpciju. Obično se koriste femtosekundni pulsni laseri, čija trenutna snaga može dostići nivo megavata. Zbog toga je talasna dužina dvofotonske fluorescencije kraća od talasne dužine ekscitacionog svetla, što je ekvivalentno efektu pobuđenja talasnom dužinom poluekscitacije.
