Razlike i karakteristike između fluorescentnih mikroskopa i običnih optičkih mikroskopa
Fluorescencijski mikroskop razlikuje se od običnog optičkog mikroskopa po tome što ne posmatra uzorke pod osvjetljenjem običnih izvora svjetlosti. Umjesto toga, koristi određenu talasnu dužinu svjetlosti (obično ultraljubičasto svjetlo, plavoljubičasto svjetlo) da pobuđuje fluorescentne supstance unutar uzorka pod mikroskopom, uzrokujući da emituju fluorescenciju. Stoga, uloga izvora svjetlosti u fluorescentnom mikroskopu nije direktno osvjetljenje, već kao izvor energije za pobuđivanje fluorescentnih tvari unutar uzorka. Razlog zašto možemo promatrati uzorke nije zbog osvjetljenja izvora svjetlosti, već fenomen fluorescencije koji pokazuju fluorescentne tvari unutar uzorka nakon apsorpcije pobuđene svjetlosne energije. Iz ovoga se vidi da je karakteristika fluorescentne mikroskopije uglavnom to što njen izvor svjetlosti može isporučiti veliku količinu ekscitacijske svjetlosti u određenom opsegu talasnih dužina, tako da fluorescentne supstance u uzorku mogu da dobiju potreban intenzitet ekscitacionog svetla. Istovremeno, fluorescentni mikroskopi moraju imati odgovarajuće sisteme filtera. Fluorescentni mikroskop je osnovni alat u hemiji fluorescentnog tkiva. Sastoji se od glavnih komponenti kao što su ultra-izvor svjetlosti visokog napona, sistem filtera (uključujući filterske ploče za pobuđivanje i potiskivanje), optički sistem i sistem za fotografisanje. Koristi svjetlost određene valne dužine da pobuđuje uzorak i emituje fluorescenciju.
1. Metode ekscitacije fluorescencije: Prema opsegu talasnih dužina svetlosti, postoje dve vrste: metoda UV ekscitacije (koristeći ultraljubičasto osvetljenje) i BV metoda ekscitacije (koristeći plavoljubičasto svetlo). Metoda UV ekscitacije koristi blisku ultraljubičastu svjetlost kraću od 400 nm za ekscitaciju. Ova metoda nema vidljivo ekscitacijsko svjetlo, tako da opažena fluorescencija pokazuje inherentnu fluorescenciju boje, što olakšava razlikovanje specifične fluorescencije na uzorku od samofluorescencije pozadinskog tkiva.
2. BV metoda ekscitacije: Uključuje ekscitaciju od ultraljubičastog do plavog svjetla sa centrom na 404nm i 434nm. Ova metoda koristi plavo svjetlo za ozračivanje uzorka, tako da isključeni-filter sistema za posmatranje fluorescencije mora koristiti filter koji može u potpunosti blokirati plavo svjetlo i u potpunosti proći kroz potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentni pigmenti koji se koriste za metodu fluorescentnih antitijela. Maksimalna apsorpciona talasna dužina ekscitacionog svetla i maksimalna talasna dužina emisije fluorescencije su relativno blizu, tako da filter koji se koristi u BV metodi ekscitacije mora da koristi filter oštrog rezanja. Ova metoda može koristiti plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je efikasnost apsorpcije fluorescentnih pigmenata visoka i mogu se dobiti svjetlije slike. Nedostatak je što se fluorescencija ispod 500nm ne može vidjeti, dok fluorescencija iznad 500nm čini da cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih antitijela, specifičnost je uglavnom određena bojom jedinstvenom za fluorescentne pigmente, tako da kada se govori o suptilnoj specifičnosti, nedostaci metode ekscitacije BV često imaju značajan utjecaj.
