Povećanje prednosti multifotonske laserske skenirajuće mikroskopije
Laserska skenirajuća multifotonska mikroskopija je veliko poboljšanje u odnosu na optičku mikroskopiju. Može da posmatra duboku strukturu živih ćelija, fiksnih ćelija i tkiva, i može da dobije jasne i oštre višeslojne Z-ravnine strukture, odnosno optičke preseke, od kojih može da konstruiše trodimenzionalnu čvrstu strukturu uzorka. Konfokalna mikroskopija koristi laserski izvor svjetlosti koji, nakon ekspanzije, ispunjava cijelu stražnju žarišnu ravan sočiva objektiva, a zatim prolazi kroz sistem sočiva objektivnog sočiva kako bi konvergirao u vrlo malu tačku na fokalnoj ravni uzorka. U zavisnosti od numeričkog otvora sočiva objektiva, prečnik najsjajnije tačke osvetljenja je oko 0.25 ~ 0.8μm, a dubina je oko 0.5 ~ 1.5μm . Veličina konfokalne tačke zavisi od dizajna mikroskopa, talasne dužine lasera, karakteristika sočiva objektiva, podešavanja statusa jedinice za skeniranje i svojstava uzorka. Opseg osvjetljenja i dubina osvjetljenja poljskog mikroskopa su veliki, dok je osvjetljenje konfokalnog mikroskopa koncentrisano na precizan fokus na fokalnoj ravni. Najosnovnija prednost konfokalne mikroskopije je da može izvršiti fino optičko sečenje debelih fluorescentnih uzoraka (koji mogu doseći 50 μm ili više), a debljina rezova je oko 0,5 do 1,5 μm. Slike serijskog optičkog preseka mogu se dobiti pomeranjem uzorka gore-dole pomoću sofisticiranog mikroskopskog koračnog motora Z-ose. Prikupljanje informacija o slici kontroliše se u preciznoj ravni bez ometanja signala koji se emituju sa drugih lokacija na uzorku. Nakon uklanjanja uticaja pozadinske fluorescencije i povećanja odnosa signal-šum, kontrast i rezolucija konfokalnih slika su značajno poboljšani u poređenju sa tradicionalnim fluorescentnim slikama osvetljenim poljem. U mnogim uzorcima, mnoge zamršene strukturne komponente su isprepletene da formiraju složene sisteme, ali kada se prikupi dovoljno optičkih sekcija, možemo ih rekonstruisati u tri dimenzije pomoću softvera. Ova eksperimentalna metoda se široko koristi u biološkim istraživanjima kako bi se razjasnili složeni strukturni i funkcionalni odnosi između stanica ili tkiva.
