Karakteristike i primjena konfokalne laserske mikroskopije
Laserski skenirajući konfokalni mikroskop (LSCM) je vrsta mikroskopa dizajnirana na temelju tehnologije konjugiranog fokusa, odnosno da se izvor laserskog svjetla, uzorak koji se testira i detektor budu u konjugiranom položaju jedan drugog.
Fundamental
U općim mikroskopima, žižna ravan sočiva objektiva poklapa se sa detektorom tako da je posmatrana ravan slike izolirana od susjedne aksijalne ravni, dok se u konfokalnim mikroskopima uzorak osvjetljava pomoću svjetlosne točke ograničene difrakcijom, a u Ovaj izolacijski efekat se postiže korištenjem rupice na putu sakupljanja svjetlosti u fokusnoj tački spot konjugata za filtriranje rasute svjetlosti kako bi se poboljšala rezolucija.
Imaging Features
Samo svjetlost koja se reflektira od konjugiranog sloja uzorka može proći kroz malu rupu na putu sakupljanja svjetlosti, a preostale nebitne refleksije sloja uzorka su blokirane malom rupom. To može rezultirati značajnim povećanjem rezolucije. U nastavku je prikazano usporedno poređenje multidimenzionalne fluorescentne mikroskopije i konfokalne mikroskopije istog debelog uzorka. Kada se napravi serija slika u različitim fokalnim ravnima, može se stvoriti ono što se obično naziva "z-stack", a ova slika prikazuje i rezoluciju i pojačanje kontrasta koje nudi konfokalna mikroskopija i osnovne uzroke ovih dobitaka. Ispitivanje slike na vrhu hrpe sa ravninom slike iznad tkiva otkriva mnogo raspršene svjetlosti na fluorescentnoj slici, dok konfokalna slika izgleda crna. Ovo smanjenje PSF-a u aksijalnom pravcu je direktno odgovorno za razliku u rezoluciji uočenoj na optičkom interfejsu u sredini z-stacka.
Još jedna karakteristika laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije je da je to tehnologija skeniranja. Tradicionalna tehnologija osvjetljenja širokog polja osvjetljava cijeli uzorak, tako da se slika može direktno snimiti golim okom ili detektorom, ali LSCM koristi snop ili višestruki fokusirani snopovi prolaze kroz uzorak za skeniranje i snimanje, a rezultirajuća slika je nazvan optička sekcija. U nastavku je prikazana razlika između tradicionalne metode širokog polja i metode konfokalnog osvjetljenja laserskog skeniranja.
Stoga je praktična metoda rada modernog konfokalnog mikroskopa prikazana na donjoj slici. Ekscitacijsko svjetlo koje emituje laser prolazi kroz dihroično ogledalo i skenira u x i y smjerovima uzorka kroz par vibrirajućih ogledala. Ekscitacija (ili refleksija) uzorka Svjetlost ulazi u PMT detektor kroz rupicu i snima se, a snimljena skenirana slika se rekonstruiše od strane kompjutera kako bi se dobila stvarna slika uzorka.
