Opažanje fluorescencije optičkim mikroskopom
Fluorescencija se odnosi na proces u kojem fluorescentna supstanca emituje svetlost veće talasne dužine skoro istovremeno kada je ozračena svetlošću određene talasne dužine (slika 1). Kada svetlost određene talasne dužine (valne dužine ekscitacije) udari u molekul, poput onih u fluoroforu, energiju fotona apsorbuju elektroni molekula. Zatim, elektroni prelaze iz osnovnog stanja (S0) u viši energetski nivo, pobuđeno stanje (S1'). Ovaj proces se naziva ekscitacija①. Elektron ostaje u pobuđenom stanju 10-9–10-8 sekundi, tokom kojih elektron gubi nešto energije②. Tokom procesa napuštanja elektrona iz pobuđenog stanja (S1) i vraćanja u osnovno stanje③, oslobađa se preostala energija apsorbovana tokom procesa ekscitacije.
Fluorescentni Jablonski dijagram
Vreme boravka fluorescentnog molekula u pobuđenom stanju je životni vek fluorescencije, koji je generalno na nivou nanosekunde, i inherentna je karakteristika samog fluorescentnog molekula. Fluorescentna doživotna slika (FLIM), koja koristi tehnologiju fluorescentnog doživotnog snimanja, može izvesti dublja funkcionalna mjerenja pored snimanja intenziteta fluorescencije i dobiti molekularnu konformaciju, međumolekularne interakcije i mikrookruženje molekula, itd. Informacije koje je teško dobiti dobiti konvencionalnim optičkim slikama.
Još jedno važno svojstvo fluorescencije je Stokesov pomak, razlika talasnih dužina između ekscitacije i emisionog vrha (slika 2). Obično je talasna dužina emisije duža od talasne dužine ekscitacije. To je zato što će elektroni izgubiti dio svoje energije kroz proces relaksacije nakon što je fluorescentna supstanca uzbuđena i prije otpuštanja fotona. Fluorescentne supstance sa većim Stokesovim pomacima lakše je posmatrati pod fluorescentnim mikroskopom.
fluorescentni mikroskop
Fluorescencijski mikroskop je optički mikroskop koji koristi svojstva fluorescencije za posmatranje i snimanje, i široko se koristi u različitim poljima kao što su ćelijska biologija, neurobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija i genetika. Fluorescentno snimanje ima prednosti visoke osjetljivosti i visoke specifičnosti, te je vrlo pogodno za promatranje distribucije specifičnih proteina i organela u tkivima i stanicama, proučavanje kolokalizacije i interakcije, praćenje životnih dinamičkih procesa kao što su promjene koncentracije jona. , itd.
Većina molekula u ćelijama ne fluorescira, a ako želite da ih vidite, označite ih fluorescentno. Postoje mnoge metode fluorescentnog obilježavanja, kao što je direktno označavanje (kao što je korištenje DAPI-a za obilježavanje DNK), ili imunološko bojenje korištenjem svojstava antitela koji vežu antigen, ili korištenje fluorescentnih proteina (kao što je GFP, zeleni fluorescentni protein) za obilježavanje ciljnih proteina , i reverzibilno vezivanje. sintetičke boje (kao što je Fura-2), itd.
Invertni fluorescentni mikroskop MF53-N
Trenutno je fluorescentni mikroskop postao standardna oprema za snimanje različitih laboratorija i platformi za snimanje i dobar je pomoćnik za naše svakodnevne eksperimente. Fluorescentni mikroskopi se uglavnom dijele u tri kategorije: uspravni fluorescentni mikroskopi (prikladni za sečenje), invertirani fluorescentni mikroskopi (prikladni za žive ćelije, uzimajući u obzir sečenje), fluorescentni stereoskopi (prikladni za veće uzorke, kao što su biljke, zebrice (odrasli/embrioni) ) , medaka, organi miša/pacova itd.).
Tehnologija snimanja fluorescentne mikroskopije se široko koristi i bogata je vrstama, a nove tehnologije se još uvijek pojavljuju. Možete odabrati tehnologiju kako biste dovršili vlastito istraživanje.
