Tehnike proširenja fokusne dubine za višefotonsku mikroskopiju
Kombinacija dvofotonskog laserskog skenirajućeg mikroskopa i indikatora kalcijuma je zlatni standard za detekciju neuronskih signala in vivo. Neuroni u neuronskim mrežama su raspoređeni u trodimenzionalnom prostoru, a praćenje dinamike njihove aktivnosti zahtijeva način da se brzo poboljša brzina snimanja volumena. Međutim, korištenjem rešetkastog skenirajućeg multifotonskog mikroskopa za snimanje velikog broja slika, ako se koristi objektiv s visokim numeričkim otvorom (NA) za postizanje veće bočne rezolucije, to će rezultirati manjom žižnom dubinom. Da bi se dobio volumen slike na maloj žižnoj dubini,
Neophodno je izvršiti skeniranje po Z osi na neki način, slikajući mnoge ravni skeniranjem svake žarišne ravni, što uvelike ograničava brzinu snimanja. Ako se informacije o aksijalnoj slici mogu žrtvovati i skeniranje volumena se može postići u jednom bočnom skeniranju proširenjem dubine fokusa, to jest, informacije o volumenu se projektuju na jednu 2D sliku, brzina snimanja se može znatno poboljšati. Ovo se naziva snimanje proširene dubine fokusa (EDF), što je posebno korisno za snimanje rijetkih struktura stanovništva koje zahtijevaju visoku vremensku rezoluciju, kao što je funkcionalno snimanje neuronske aktivnosti.
Aksijalna i lateralna rezolucija mikroskopa određene su numeričkom aperturom (NA) sočiva objektiva. Visok NA može maksimizirati aksijalnu i bočnu rezoluciju, kao i količinu prikupljene svjetlosti; Niži NA će rezultirati nižom aksijalnom rezolucijom, odnosno većom dubinom fokusa, ali će istovremeno žrtvovati lateralnu rezoluciju i efikasnost sakupljanja svjetlosti. Metoda proširenja dubine fokusa koja će biti uvedena u nastavku može to postići uz održavanje visoke bočne rezolucije i dovoljnog svjetlosnog toka.
Upotreba prostornih modulatora svjetlosti za generiranje fokalnih vitkih Besselovih zraka može postići EDF snimanje, ali modulatori prostornog svjetla su glomazni i teško ih je kompatibilni sa uskim prostorima mikroskopa; Nasuprot tome, Besselovi moduli bazirani na aksijalnim piramidama su jeftini i kompaktni, ali mogu generirati samo žarišne točke fiksne dubine i nisu prikladni za razne eksperimente koji zahtijevaju kontinuirane promjene fokusne dubine. Kako bi riješili ovaj problem, 2018. RONGWEN LU et al. demonstrirao Bessel modul baziran na aksikonu, u kojem samo jedno sočivo treba prevesti duž optičke ose kako bi se kontinuirano podešavala aksijalna dužina Beselove žarišne tačke.
