Kako se fluorescentna mikroskopija razlikuje od konvencionalne mikroskopije
Nedavno sam pokušao napraviti neke zamrznute dijelove miševa, a sada moram koristiti fluorescentni mikroskop da vidim da li je virus koji sam ubrizgao u željeno područje mozga. Neke osnovne principe fluorescentne mikroskopije potrebno je ukratko proučiti, a ja ću ih također ovdje podijeliti.
Fluorescencijski mikroskop koristi ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti za osvjetljavanje objekta koji se testira, uzrokujući da objekt emituje izvor svjetlosti, a zatim promatra predmet pod mikroskopom. Uglavnom se koristi za imunofluorescentne ćelije, a sastoji se od izvora svetlosti, sistema filterskih ploča i optičkog sistema za posmatranje fluorescentne slike uzorka kroz uvećanje okulara i sočiva objektiva. Pogledajmo razliku između ovog fluorescentnog mikroskopa i običnog optičkog mikroskopa.
1. U pogledu metoda osvjetljenja
Metoda osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa općenito se koristi metodom padajućeg snopa, što znači da se izvor svjetlosti projektuje na ispitni uzorak kroz objektiv objektiva.
2. U smislu rezolucije
Fluorescentna mikroskopija koristi ultraljubičasto svjetlo kao izvor svjetlosti, s relativno kratkom talasnom dužinom, ali višom rezolucijom od običnih optičkih mikroskopa.
3. Razlike na filteru
Fluorescencijski mikroskop koristi dva posebna filtera, jedan ispred izvora svjetlosti za filtriranje vidljive svjetlosti, a drugi između objektiva i okulara za filtriranje ultraljubičastog svjetla, koje može zaštititi oči.
Fluorescentna mikroskopija je takođe vrsta optičkog mikroskopa, uglavnom zato što je talasna dužina pobuđena fluorescentnom mikroskopom kratka, što dovodi do razlika u strukturi i upotrebi fluorescentne mikroskopije i obične mikroskopije. Većina fluorescentnih mikroskopa ima dobru funkciju hvatanja slabe svjetlosti, tako da je njihova sposobnost snimanja dobra i pod ekstremno slabom fluorescencijom. Osim toga, uz kontinuirano poboljšanje fluorescentne mikroskopije posljednjih godina, buka je također značajno smanjena. Stoga se sve više primjenjuju fluorescentni mikroskopi.
Znanja vezana za dvofotonsku fluorescentnu mikroskopiju
Osnovni princip dvofotonske ekscitacije je da pri velikoj gustini fotona, fluorescentni molekuli mogu istovremeno apsorbirati dva fotona duge talasne dužine, a nakon kratkog perioda života u takozvanom pobuđenom stanju, emituju foton kraće talasne dužine; Njegov efekat je isti kao korišćenje fotona sa talasnom dužinom od polovine duge talasne dužine za pobuđivanje fluorescentnih molekula. Dvofotonsko pobuđivanje zahtijeva veliku gustinu fotona, a kako bi se izbjeglo oštećenje ćelija, u dvofotonskom mikroskopu se koristi visokoenergetski impulsni laser sa zaključavanjem moda. Laser koji emituje ovaj tip lasera ima visoku vršnu energiju i nisku prosječnu energiju, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom od 80 do 100 megaherca. Kada se koristi objektiv s velikim numeričkim otvorom za fokusiranje fotona impulsnog lasera, gustina fotona u žarišnoj tački objektiva je najveća, a dvofotonska ekscitacija se javlja samo u žarištu objektiva. Stoga, dvofotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalne rupice, što poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije.
U općim fenomenima fluorescencije, zbog niske gustine fotona ekscitacije, fluorescentni molekul može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitovati jedan fluorescentni foton kroz tranziciju zračenja, što se naziva fluorescencija jednog fotona. Za proces pobuđivanja fluorescencije koristeći laser kao izvor svjetlosti, mogu se pojaviti dvofotonski ili čak višefotonski fenomeni fluorescencije. U ovom trenutku, izvor pobuđene svjetlosti koji se koristi je visokog intenziteta, a gustina fotona zadovoljava zahtjev da fluorescentni molekuli apsorbuju dva fotona istovremeno. U procesu korištenja tipičnog lasera kao pobudnog izvora svjetlosti, gustina fotona još uvijek nije dovoljna za generiranje dvofotonske apsorpcije. Obično se koriste femtosekundni pulsni laseri, čija trenutna snaga može dostići nivo od megavata. Zbog toga je talasna dužina dvofotonske fluorescencije kraća od talasne dužine ekscitacije, što je ekvivalentno efektu koji proizvodi pobuđivanje talasnom dužinom pola pobuđenja.
