Koliko znate o fluorescentnoj mikroskopiji
Fluorescencijski mikroskopi općenito koriste živine lampe visokog intenziteta kao izvore pobuđenog svjetla. Filteri se koriste za filtriranje neželjene svjetlosti, ostavljajući samo čisto svjetlo visokog intenziteta koje pobuđuje fluorofor. Nakon što monokromatsko svjetlo ozrači uzorak kroz objektiv objektiva, uzorak će biti pobuđen da emituje svjetlost (fluorescencija), a i fluorescencija i ekscitacijsko svjetlo će se vratiti duž optičke putanje sočiva objektiva. U ovom slučaju, potrebno je dikroično ogledalo za filtriranje pobudnog svjetla. , propuštajući samo fluorescenciju koju treba da vidimo.
Ova fluorescencija dospijeva do okulara duž svjetlosnog puta mikroskopa, a zatim ulazi u naše oči, gdje možemo vidjeti fluorescenciju koju emituje fluorofor.
Prethodna provjera i podešavanje fluorescentnog mikroskopa:
(1) Prije svakog promatranja fluorescencije, potrebno je rutinski provjeriti poravnanje filamenta, fokus optičke putanje, otvor dijafragme i postavke dijafragme polja fluorescentnog uređaja.
(2) Da li je potreban sklop fluorescentnog pobuđivanja/emisionog filtera instaliran u pretvarač, da li je sočivo objektiva fluorescentnog mikroskopa pravilno konfigurisano i da li je uklonjene mrlje od ulja i prašine na prednjem sočivu objektiva.
(3) Ako se istovremeno vrši promatranje faznog kontrasta propuštene svjetlosti, potrebno je provjeriti konjugaciju centra kondenzatora i faznog kontrastnog prstena nasuprot objektivu.
(4) Provjerite da li je nosač uzorka (klizno staklo, pokrovno staklo i drugi pribor) prekriven tekućinom ili prašinom i da li je debljina unutar kalibriranog raspona radne udaljenosti sočiva objektiva. Narezani uzorak ne smije biti previše debeo, po mogućnosti manji od ili jednak 10 μm.
(5) Budući da izvor rasvjete sadrži ultraljubičaste zrake, smeđa ploča za zaštitu od svjetlosti postavljena je iznad prednjeg dijela pozornice kako bi se spriječilo da ultraljubičasti zraci oštete mrežnicu.
(6) Nestabilnost napona će smanjiti radni vek živine lampe visokog pritiska, a napajanje izvora svetlosti je opremljeno stabilizatorom napona.
(7) Da bi se produžio životni vijek živine lampe, može se isključiti 15 minuta nakon što je uključena; nakon što se fluorescentna snaga živine lampe isključi, potrebno je pričekati najmanje 10 minuta da ponovo pokrene živinu paru da se ohladi i vrati u prvobitno stanje, inače će život lampe biti ugrožen.
Posmatranje slike fluorescentnim mikroskopom:
(1) Otprilike 5-10 minuta nakon uključivanja fluorescentnog izvora svjetlosti, intenzitet pobudnog svjetla ima tendenciju da bude stabilan, a uzorak se puni za posmatranje; kako bi se spriječilo gašenje fluorescencije uzorka uzrokovano prekomjernom ekscitacijskom svjetlošću tokom procesa fokusiranja i traženja objekata, prvo umanjite fluorescentni mikroskop. Podesite ekscitacijsko svjetlo na umjereni intenzitet pomoću dijafragme otvora ili dodajte ND filter, i redovno pomerajte fazu uzorka. Nakon što potvrdite sliku u ogledalu, podesite na fluorescentno stanje za snimanje i snimanje.
(2) Podešavanja za loš kvalitet slike. Pored faktora pripreme uzorka, neophodna podešavanja koja se mogu izvršiti su:
① Izuzmite uređaje koji štite ili ograničavaju svjetlost u optičkoj putanji slike, kao što su DIC dodaci, ND filteri itd.
②Ponovo podesite fokus prijemnika i veličinu dijafragme blende fluorescentnog mikroskopa.
③ Pažljivo podesite prsten za korekciju razlike u pokrivenosti sočiva objektiva fluorescentnog mikroskopa.
Tačke primjene fluorescentne mikroskopije
Fluorescentna mikroskopija koristi snimanje "aktiničke fluorescencije". Ako je odabrana talasna dužina ekscitacije u skoro ultraljubičastom području (320-400nm), što je nevidljivo golim okom, emisioni spektar fluorescencije je također kraći od prosječne talasne dužine običnih izvora svjetlosti ogledala. poboljšati. Visokoenergetski fotoni se sudaraju sa elektronima, uzrokujući prelazak elektrona iz osnovnog u pobuđeno stanje. Elektroni u pobuđenom stanju su vrlo nestabilni i vratit će se u osnovno stanje. U tom procesu će se potrošiti dio toplinske energije i emitovati novi fotoni. Novi foton ima nižu energiju od originalnog fotona i stoga ima veću valnu dužinu. Kako je nova talasna dužina fotona drugačija od talasne dužine fotona upadne svetlosti, dva snopa svetlosti različitih talasnih dužina se odvajaju određenom metodom optičke obrade, tako da vidimo samo emitovane nove fotone (fluorescentni signal), tj. fluorescentni mikroskop vidi fluorescentne slike.
