Uvod u prednosti i ograničenja višefotonske laserske skenirajuće mikroskopije
Višefotonska laserska skenirajuća mikroskopija je eksperimentalna tehnika razvijena na bazi laserske skenirajuće mikroskopije. Pruža vrhunske performanse optičkog sečenja za trodimenzionalno posmatranje.
Metoda višefotonske ekscitacije fluorescencije koristi dugovalnu crvenu svjetlost ili blisku infracrvenu svjetlost za dobijanje fluorescentnih slika visoke rezolucije uzoraka. Prouzrokuje minimalno oštećenje živih uzoraka i stoga je pogodan za snimanje živih ćelija, posebno za slikovno istraživanje debelih živih tkiva kao što su moždane kriške, embriji, cijeli organi, pa čak i cijeli organizmi.
Njegove glavne prednosti su sažete na sljedeći način:
Ekscitacija se izvodi crvenim ili infracrvenim svjetlom, koje karakterizira slabo rasipanje svjetlosti. (Rasipanje malim česticama je obrnuto proporcionalno četvrtom stepenu talasne dužine.)
Nije potrebna rupica, što omogućava efikasnije prikupljanje rasutih fotona iz ravni snimanja.
Rupa ne može razlikovati raspršene fotone emitovane iz defokusiranih područja u odnosu na fokalnu zonu; multifotonska mikroskopija pruža odličan omjer signala i šuma za snimanje dubokog tkiva.
Ultraljubičasto ili vidljivo svjetlo koje se koristi u jednofotonskoj ekscitaciji lako se apsorbira i prigušuje uzorcima prije nego što dosegnu žarišnu ravan, što otežava postizanje duboke ekscitacije.
U biološkom mikroskopskom posmatranju, primarno razmatranje je očuvanje fiziološke aktivnosti organizama, održavanje normalnog sadržaja vode, koncentracije jona i cirkulacije kiseonika i hranljivih materija. Tokom optičkog posmatranja, i stvaranje toplote i energija fotona moraju se održavati unutar nivoa izloženosti koji ne uzrokuje oštećenje ćelije.
Multifotonska mikroskopija ima brojne dodatne prednosti. Pokazuje neuporedive prednosti u odnosu na konvencionalne laserske mikroskope u smislu trodimenzionalne rezolucije, dubine prodiranja, efikasnosti raspršenja, potiskivanja pozadinske buke, odnosa signal-šum i kontrole slike.
Višefotonska konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija primijenjena je u širokom spektru istraživačkih i praktičnih polja. Omogućava neinvazivno trodimenzionalno posmatranje uzoraka u prirodnim uslovima uz poboljšanje rezolucije i odnosa signal-šum sistema. Koristeći promjene svojstava materijala izazvane višefotonskom pobudom, također omogućava pohranjivanje trodimenzionalnih podataka visoke gustoće i mikrofabrikaciju u proizvoljnim trodimenzionalnim smjerovima, pokazujući veliku vrijednost primjene.
Predvidljivo je da će daljim napretkom mehanike, nauke o materijalima, laserske tehnologije i drugih srodnih disciplina, multifotonska konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija postići veći napredak i šire izglede za primjenu.
