Znanje o dvo{0}}fotonskoj fluorescentnoj mikroskopiji
Osnovni princip ekscitacije s dva{0}}fotona je da pri velikoj gustini fotona, fluorescentni molekuli mogu istovremeno apsorbirati dva fotona duge talasne dužine i emitovati foton kraće talasne dužine nakon kratkog perioda takozvanog vijeka trajanja tako-pobuđenog stanja; Učinak je isti kao korištenje fotona sa polovinom talasne dužine duge talasne dužine za pobuđivanje fluorescentnih molekula. Dvofotonska ekscitacija zahtijeva visoku gustinu fotona, a kako bi se izbjeglo oštećenje ćelija, dvofotonska mikroskopija koristi visoko{4}}energetski režim-zaključanih pulsnih lasera. Laser koji emituje ovaj laser ima visoku vršnu energiju i nisku prosečnu energiju, sa širinom impulsa od samo 100 femtosekundi i frekvencijom od 80 do 100 megaherca. Kada se koristi objektiv objektiva s velikim numeričkim otvorom za fokusiranje fotona impulsnog lasera, gustina fotona u fokusnoj tački sočiva objektiva je najveća, a ekscitacija dva-fotona se javlja samo u fokusnoj tački sočiva objektiva. Stoga, dvofotonski mikroskop ne zahtijeva konfokalnu rupicu, što poboljšava efikasnost detekcije fluorescencije.
U općenitom fenomenu fluorescencije, zbog niske gustine fotona ekscitacijske svjetlosti, fluorescentni molekul može apsorbirati samo jedan foton u isto vrijeme, a zatim emitovati drugi fluorescentni foton kroz radijacioni prijelaz, što je poznato kao fluorescencija jednog fotona. Za procese pobuđivanja fluorescencije koji koriste lasere kao izvore svjetlosti, mogu se javiti dvo-fotonski ili čak višefotonski fenomeni fluorescencije. U ovom slučaju, izvor pobuđene svjetlosti koji se koristi ima visok intenzitet i gustinu fotona koji zadovoljavaju zahtjeve da fluorescentni molekuli apsorbuju dva fotona istovremeno. U procesu korištenja općeg lasera kao izvora pobudne svjetlosti, gustina fotona je još uvijek nedovoljna da proizvede fenomen apsorpcije dva{4}}fotona. Obično se koriste femtosekundni pulsni laseri, sa trenutnom snagom koja dostiže nivo megavata. Zbog toga je talasna dužina fluorescencije sa dva-fotona kraća od talasne dužine ekscitacione svetlosti, što je ekvivalentno efektu koji proizvodi pobuđivanje talasnom dužinom pola pobuđenja.
