Znanja vezana za konfokalnu fluorescentnu mikroskopiju
Osnovni princip konfokalne fluorescentne mikroskopije je korištenje točkastog izvora svjetlosti za ozračivanje uzorka, formirajući dobro definiranu malu tačku na fokalnoj ravni. Fluorescenciju koju emituje tačka nakon ozračivanja sakuplja sočivo objektiva i šalje nazad u spektrofotometar sastavljen od dvosmernog ogledala u boji duž originalne putanje zračenja. Spektrofotometar šalje fluorescenciju direktno na detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalaze se dvije rupice, odnosno rupice za osvjetljenje i rupice za detekciju. Geometrijske dimenzije ova dva su konzistentne, oko 100-200nm; U poređenju sa svetlosnom tačkom na fokalnoj ravni, ova dva su konjugirana, što znači da svetlosna tačka prolazi kroz niz sočiva i na kraju se može istovremeno fokusirati i na otvor za osvetljenje i na otvor za detekciju. Na ovaj način, svjetlost iz fokalne ravni može konvergirati unutar dometa detekcijske rupe, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod fokalne ravni blokirana izvan otvora za detekciju i ne može se snimiti. Skeniranjem uzorka tačku po tačku laserom, fotomultiplikator nakon detekcije rupice takođe dobija odgovarajuću konfokalnu sliku tačke po tačku svetlosti, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na računar. Konačno, na ekranu se sintetizira jasna konfokalna slika cijele fokalne ravni.
Svaka slika u fokalnoj ravni je zapravo optički poprečni presjek uzorka, koji uvijek ima određenu debljinu, poznat i kao optički tanak presjek. Zbog činjenice da je intenzitet svjetlosti u žarišnoj tački mnogo veći od intenziteta u nefokalnoj tački, a svjetlost u nefokalnoj ravni se filtrira rupicama, dubina polja konfokalnog sistema je približno nula. Skeniranjem duž pravca Z-ose može se postići optička tomografija, formirajući dvodimenzionalni optički presek u fokusnoj tački posmatranog uzorka. Kombinacijom skeniranja u ravni XY (fokalna ravan) sa skeniranjem po Z-osi (optička osa), trodimenzionalna slika uzorka može se dobiti akumuliranjem kontinuiranih slojeva dvodimenzionalnih slika i njihovom obradom specijalizovanim kompjuterskim softverom.
Rupa za detekciju i rupica izvora svjetlosti su uvijek fokusirani na istu tačku, tako da fluorescencija pobuđena izvan ravni fokusiranja ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserske konfokalne mikroskopije je da ona koristi laser kao izvor svjetlosti i dodaje uređaj za lasersko skeniranje i konjugirani uređaj za fokusiranje na osnovu tradicionalne fluorescentne mikroskopije. To je sistem kojim upravlja kompjuter za akviziciju i obradu digitalne slike.
