Laserska konfokalna mikroskopija - karakteristike i primjene
Laserska skenirajuća konfokalna mikroskopija (LSCM) je vrsta mikroskopa dizajnirana na temelju tehnologije konjugiranog fokusa, to jest, izvor laserskog svjetla, uzorak koji se mjeri i detektor su svi u konjugiranim pozicijama jedni s drugima.
Fundamental
U opštem mikroskopu, ravan slike posmatranja se izoluje od susedne aksijalne ravni tako što se poklapa fokalna ravan sočiva objektiva sa detektorom, dok se u konfokalnom mikroskopu svetlosna tačka ograničena difrakcijom koristi da osvetli uzorak i A pinhole se koristi u sakupljenoj svjetlosnoj putanji na konjugiranom fokusu svjetlosne točke za filtriranje zalutalog svjetla kako bi se stvorio ovaj izolacijski efekat i time poboljšala rezolucija.
Karakteristike slikanja
Optički dio skeniranja slike
Još jedna karakteristika laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije je da je to tehnologija skeniranja. Tradicionalna tehnologija osvjetljenja širokog polja osvjetljava cijeli uzorak, tako da se slika može snimiti direktno golim okom ili detektorom, ali LSCM koristi snop ili višestruki fokusirani snopovi prolaze kroz uzorak za skeniranje i snimanje. Rezultirajuća slika naziva se optički presjek. U nastavku je prikazana razlika između tradicionalne metode širokog polja i metode konfokalnog osvjetljenja laserskog skeniranja.
Stoga je stvarna metoda rada modernog konfokalnog mikroskopa kao što je prikazano na donjoj slici. Ekscitacijsko svjetlo koje emituje laser prolazi kroz dihroično ogledalo i skenira se u smjeru x i y uzorka kroz par galvanometara. Ekscitacija (ili refleksija) uzorka je Svetlost koja ulazi u PMT detektor kroz rupicu i snima se, a snimljena skenirana slika se rekonstruiše od strane kompjutera kako bi se rekonstruisala stvarna slika uzorka.
Generirajte "z-stack" slike na različitim fokalnim ravnima
Samo svjetlost koja se reflektira od konjugiranog sloja uzorka može proći kroz malu rupu na putu sakupljanja svjetlosti, a preostale nebitne refleksije sloja uzorka su blokirane malom rupom. To može rezultirati značajnim poboljšanjima rezolucije. Usporedno poređenje multidimenzionalne fluorescentne mikroskopije i konfokalne mikroskopije istog debelog uzorka. Kada se napravi serija slika u različitim fokalnim ravnima, mogu se generisati slike koje se obično nazivaju "z-stackovima", koje ilustruju dobitke rezolucije i kontrasta koje nudi konfokalna mikroskopija i osnovne uzroke ovih pojačanja. Može se vidjeti da se ispitivanjem slike na vrhu hrpe s ravninom snimanja iznad tkiva otkriva velika količina raspršene svjetlosti na fluorescentnoj slici, dok slika konfokalne mikroskopije izgleda crna. Ovo smanjenje aksijalnog PSF-a direktno rezultira razlikom u rezoluciji uočenoj na optičkom interfejsu u sredini z-stacka.
Rezolucija je znatno poboljšana u poređenju sa širokom rasvjetom
U fluorescentnoj mikroskopiji, intenzitet svjetlosti emitiran iz jedne tačke opisuje se funkcijom širenja tačke (PSF), a njen uzorak je Airy disk. Rezolucija fluorescentnog sistema može se opisati radijusom Airy diska, koji se može opisati kao Numerički otvor objektiva i talasna dužina ekscitacionog svetla određuju
