Metode za proširenje fokusne dubine višefotonskih mikroskopa
Kombinacija dvo-fotonskog laserskog skenirajućeg mikroskopa i indikatora kalcijuma je zlatni standard za detekciju neuronskih signala in vivo. Neuroni u neuronskim mrežama su raspoređeni u trodimenzionalnom prostoru-i praćenje dinamike njihove aktivnosti zahtijeva način da se brzo poboljša brzina snimanja volumena. Međutim, korištenjem rešetkastog skenirajućeg multifotonskog mikroskopa za snimanje velikog broja slika, ako se koristi objektiv s visokim numeričkim otvorom (NA) za postizanje veće lateralne rezolucije, to će rezultirati manjom žižnom dubinom. Da bi se dobio volumen slike na maloj žižnoj dubini,
Neophodno je izvršiti skeniranje Z-ose na neki način, slikajući više ravni skeniranjem svake fokalne ravni, što u velikoj mjeri ograničava brzinu snimanja. Ako se informacije o aksijalnoj slici mogu žrtvovati i skeniranje volumena se može postići u jednom bočnom skeniranju proširenjem dubine fokusa, odnosno, informacije o volumenu se projiciraju na jednu 2D sliku, brzina snimanja može se znatno poboljšati. Ovo se naziva snimanje proširene dubine fokusa (EDF), što je posebno korisno za snimanje rijetkih struktura stanovništva koje zahtijevaju visoku vremensku rezoluciju, kao što je funkcionalno snimanje neuronske aktivnosti.
Aksijalna i lateralna rezolucija mikroskopa određene su numeričkom aperturom (NA) sočiva objektiva. Visok NA može maksimizirati aksijalnu i bočnu rezoluciju, kao i količinu prikupljene svjetlosti; Niži NA će rezultirati nižom aksijalnom rezolucijom, odnosno većom dubinom fokusa, ali će istovremeno žrtvovati lateralnu rezoluciju i efikasnost sakupljanja svjetlosti. Metoda proširenja dubine fokusa koja će biti uvedena u nastavku može to postići uz održavanje visoke bočne rezolucije i dovoljnog svjetlosnog toka.
Upotreba prostornih modulatora svjetlosti za generiranje fokalnih vitkih Besselovih zraka može postići EDF snimanje, ali modulatori prostornog svjetla su glomazni i teško ih je kompatibilni sa uskim prostorima mikroskopa; Nasuprot tome, Besselovi moduli bazirani na aksijalnim piramidama su jeftini i kompaktni, ali mogu generirati samo žarišne točke fiksne dubine i nisu prikladni za razne eksperimente koji zahtijevaju kontinuirane promjene fokusne dubine. Kako bi riješili ovaj problem, 2018. RONGWEN LU et al. demonstrirao Bessel modul baziran na aksikonu, u kojem samo jedno sočivo treba biti prevedeno duž optičke ose da bi se kontinuirano podešavala aksijalna dužina Beselove fokusne tačke.
Slika 1 (a) Dijagram uređaja Besselovog modula; (b) Funkcija širenja tačke eksperimentalno je izmjerena kada je D bio -12 mm, 0 mm, odnosno 12 mm; (c) Odnos između bočne pune širine na pola maksimuma, (d) aksijalne pune širine na pola maksimuma, (e) vršnog signala i (f) optičke snage iza objektiva sa L2 pomakom D
Modul uređaj za formiranje Beselove žarišne tačke promenljive dužine prikazan je na slici 1a. Upadni Gausov snop se oblikuje u kružni snop nakon prolaska kroz aksikon i sočivo L1. Naredna maska kružnog otvora može blokirati zalutalu svjetlost uzrokovanu defektima aksikona, oblikujući na taj način aksijalnu distribuciju funkcije širenja tačke pobuđivanja dva-fotona. Nakon toga, svjetlosni snop se projektuje na galvanometar pomoću sočiva L2 i L3, a zatim preko sočiva L4 i L5 stiže do zadnje žižne ravni sočiva objektiva.
Ovi dizajni su slični tradicionalnim piramidalnim baziranim modulima, s tom razlikom što se pomeranjem L2 ili L3 duž optičke ose, aksijalna dužina Beselovog fokusa može kontinuirano podešavati. Slika 1b prikazuje funkcije širenja aksijalnih tačaka za D vrijednosti -12 mm, 0 mm i 12 mm, sa punom aksijalnom širinom na pola maksimuma od 39? m,24? M i 14? m. Kao što je prikazano na slici 1c-f, pomicanje sočiva L2 s lijeva na desno može kontinuirano promijeniti punu širinu na pola maksimuma iu poprečnom i u aksijalnom smjeru, što znači da se dubina fokusa može kontinuirano mijenjati. Rezultati numeričke simulacije zasnovani na teoriji vektorske difrakcije dobro se slažu s eksperimentalnim podacima. Slika 2. potvrđuje korekcijski učinak različitih veličina prstenastih maski na defekte aksikona. Utvrđeno je da tanje prstenaste maske mogu bolje optimizirati distribuciju aksijalnog intenziteta izlaznog Besselovog snopa, ali u isto vrijeme dovode i do većeg gubitka snage.
