Klasifikacija mikroskopa i princip rada za istraživanje ćelija
Mikroskop je primarni alat za posmatranje ćelija. Prema različitim izvorima svjetlosti, može se podijeliti u dvije kategorije: optički mikroskopi i elektronski mikroskopi. Prvi koristi vidljivo svjetlo (UV mikroskopi koriste ultraljubičasto svjetlo) kao izvor svjetlosti, dok drugi koristi elektronske zrake kao izvor svjetlosti.
-,Optički mikroskop
(1) Običan optički mikroskop
Obični biološki mikroskopi se sastoje od tri dijela, i to: ① sistema osvjetljenja, uključujući izvor svjetlosti i kondenzator; ② Sistem optičkog uvećanja, koji se sastoji od objektiva i okulara, koji je glavno tijelo mikroskopa. Da bi se eliminisala sferna aberacija i hromatska aberacija, i okular i objektiv ③Mehanički uređaj, koji se koristi za fiksiranje materijala i olakšavanje posmatranja (slika 2-1).
Da li je slika mikroskopa jasna ne određuje se samo povećanjem, već se odnosi i na rezoluciju mikroskopa. Rezolucija se odnosi na sposobnost mikroskopa (ili ljudskog oka da bude udaljeno 25 cm od mete) da razlikuje najmanju udaljenost između objekata. Veličina rezolucije određena je talasnom dužinom i odnosom otvora svetlosti i indeksom prelamanja medija se izražava formulom:
U formuli: n=indeks prelamanja medija;=ugao otvora blende (ugao otvaranja uzorka prema otvoru sočiva objektiva), NA=otvor blende (numerički otvor blende). Ugao sočiva je uvijek manji od 180 stepeni, tako da maksimalna vrijednost sina/2 mora biti manja od 1.
Indeks prelamanja stakla koji se koristi za izradu optičkog sočiva je 1,65 do 1,78, a indeks prelamanja medija koji se koristi je bliži staklu, to bolje. Za suva sočiva objektiva, medij je zrak, a omjer blende objektiva je općenito 0.05 do 0,95; za uljne leće, kedrovo ulje se koristi kao medij, a omjer otvora objektiva može biti blizu 1,5.
Talasna dužina obične svjetlosti je {{0}}nm, tako da vrijednost rezolucije mikroskopa neće biti manja od 0.2μm, a rezolucija ljudskog oka je 0,2mm, tako da maksimalno uvećanje opšteg dizajna mikroskopa je obično 1000X.
(2) Fluorescentna mikroskopija
Neke supstance u ćelijama, kao što je hlorofil, mogu fluorescirati nakon zračenja ultraljubičastim zracima; neke supstance same po sebi ne mogu fluorescirati, ali ako su obojene fluorescentnim bojama ili fluorescentnim antitelima, mogu fluorescirati i kada su ozračene ultraljubičastim zracima, a fluorescentni mikroskop (sl. 2-2, 3, 4) je jedan od alata za kvalitativna i kvantitativna istraživanja takvih supstanci.
Fluorescencijski mikroskopi i obični mikroskopi imaju sljedeće razlike:
1. Metoda osvjetljenja je obično epi-iluminacija, odnosno izvor svjetlosti se projektuje na uzorak kroz sočivo objektiva (slika 2-3);
2. Izvor svjetlosti je ultraljubičasto svjetlo, valna dužina je kraća, a rezolucija je veća od one kod običnih mikroskopa;
3. Postoje dva specijalna filtera, onaj ispred izvora svjetlosti služi za filtriranje vidljive svjetlosti, a onaj između okulara i sočiva objektiva se koristi za filtriranje ultraljubičastog svjetla radi zaštite očiju.
(3) Laserski skenirajući konfokalni mikroskop
Laserski konfokalni skenirajući mikroskop (laserski konfokalni skenirajući mikroskop, slika 2-5, 6) koristi laser kao izvor svjetlosti za skeniranje i skenira sliku tačku po tačku, liniju po liniju, površinu po površinu, a skenirajući laser i fluorescentna kolekcija dijele sočivo objektiva, a fokus sočiva objektiva je Fokalna tačka skenirajućeg lasera je takođe i tačka objekta trenutnog snimanja. Budući da je talasna dužina laserskog snopa kratka, a snop vrlo tanak, konfokalni laserski skenirajući mikroskop ima višu rezoluciju, koja je oko 3 puta veća od običnog optičkog mikroskopa. Sistem je fokusiran jednom i skeniranje je ograničeno na jednu ravan uzorka. Kada je dubina fokusiranja različita, mogu se dobiti slike različitih nivoa dubine uzorka. Ove informacije o slici se pohranjuju u računar. Putem kompjuterske analize i simulacije može se prikazati trodimenzionalna struktura uzorka ćelije.
Konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija se može koristiti ne samo za posmatranje morfologije ćelije, već i za kvantitativnu analizu intracelularnih biohemijskih komponenti, statistiku optičke gustoće i merenje morfologije ćelije.
(4) Mikroskop tamnog polja
Mikroskop tamnog polja (mikroskop tamnog polja, slika 2-7) ima svjetlosni list u sredini kondenzatora, tako da svjetlo osvjetljenja ne ulazi direktno u ljudsko sočivo, već samo svjetlost koju reflektuje i difrakuje uzorak dozvoljeno je da uđe u sočivo objektiva, tako da je pozadina vidnog polja crna, ivice objekata su svetle. Koristeći ovaj mikroskop, čestice male veličine od 4-200nm se mogu vidjeti, a rezolucija može biti 50 puta veća od one kod običnih mikroskopa.
(5) Fazni kontrastni mikroskop
Fazokontrastni mikroskop (fazokontrastni mikroskop, slika 2-8, 9) P. Zernikea izumljen je 1932. godine i za njega je dobio Nobelovu nagradu za fiziku 1953. godine. Najveća karakteristika ovog mikroskopa je da može posmatrati neobojene uzorke i žive ćelije.
Osnovni princip faznokontrastne mikroskopije je da se razlika optičkog puta vidljive svjetlosti koja prolazi kroz uzorak promijeni u razliku amplitude, čime se poboljšava kontrast između različitih struktura i čine različite strukture jasno vidljivim. Nakon prolaska kroz uzorak, svjetlost se lomi, odstupa od prvobitne optičke putanje i kasni za 1/4λ (talasna dužina). Pojačajte, povećajte ili smanjite amplitudu, povećajte kontrast. U pogledu strukture, fazni kontrastni mikroskopi imaju dvije posebne karakteristike koje se razlikuju od običnih optičkih mikroskopa:
1. Prstenasta dijafragma se nalazi između izvora svjetlosti i kondenzatora, a njena funkcija je da svjetlost koja prolazi kroz kondenzator formira šuplji svjetlosni stožac i fokusira se na uzorak.
2. Fazna ploča (prstenasta fazna ploča) dodaje faznu ploču obloženu magnezijum fluoridom u sočivo objektiva, što može odgoditi fazu direktne ili difraktirane svjetlosti za 1/4λ. Postoje dvije vrste:
①A plus fazna ploča: Direktno svjetlo kasni za 1/4λ. Nakon što se spoje dvije grupe svjetlosnih valova, svjetlosni valovi se sabiraju, a amplituda se povećava. Struktura uzorka je svjetlija od okolnog medija, stvarajući svijetli kontrast (ili negativan kontrast).
② B plus fazna ploča: Difraktovana svjetlost kasni za 1/4λ. Nakon što se dva seta zraka spoje, svjetlosni valovi se oduzimaju, a amplituda postaje manja, formirajući tamni kontrast (ili pozitivan kontrast), a struktura je tamnija od okolnog medija.
(6) Polarizacijski mikroskop
Polarizacijski mikroskop se koristi za otkrivanje supstanci sa dvostrukim lomom, kao što su filamenti, vretena, kolagen, hromozomi i tako dalje. Razlika od običnih mikroskopa je u tome što se ispred izvora svjetlosti nalazi polarizator (polarizator), tako da je svjetlost koja ulazi u mikroskop polarizirana svjetlost, a nalazi se analizator (polarizator čiji je smjer polarizacije okomit na polarizator) cijev sočiva. Stupanj ovog mikroskopa može se rotirati. Kada se na scenu stavi supstanca sa jednim prelamanjem, bez obzira na to kako je pozornica rotirana, pošto su dva polarizatora vertikalna, u mikroskopu se ne može videti svetlost, a svetlost nije vidljiva u mikroskopu. Prilikom ulaska u dvolomne materijale, rotirajući stepen može otkriti takve objekte jer se svjetlost odbija dok prolazi kroz takve materijale.
