Principi konfokalne mikroskopije
Konfokalni mikroskop je instrument za snimanje visoke preciznosti koji se pojavio i razvio 1980-ih godina i predstavlja bitan naučnoistraživački instrument za proučavanje submikronskih struktura. Sa razvojem računara, softvera za obradu slike i lasera, konfokalni mikroskopi su takođe doživeli veliki razvoj, i sada se široko koriste u oblastima biologije, mikrosistema i merenja materijala. Konfokalni mikroskop je nova vrsta mikroskopa koji integriše konfokalni princip, tehnologiju skeniranja i tehnologiju obrade kompjuterske grafike. Njegove glavne prednosti su: visoka lateralna rezolucija i visoka aksijalna rezolucija, te efektivno suzbijanje rasute svjetlosti, uz visok kontrast.
Tipična postavka konfokalnog mikroskopa je postavljanje dvije male rupe na konjugiranu ravninu žarišne ravni mjernog objekta, od kojih je jedna postavljena ispred izvora svjetlosti, a druga ispred detektora, kao što je prikazano na slici. 1. Sa slike se može vidjeti da kada je izmjereni uzorak u kvazi-fokusnoj ravni, intenzitet svjetlosti prikupljen na kraju detekcije je najveći; kada je izmjereni uzorak u položaju van fokusa, svjetlosna tačka na kraju detekcije difundira i intenzitet svjetlosti se brzo smanjuje. Dakle, samo svjetlost koju emituju tačke na fokalnoj ravni može proći kroz izlaznu pinhole, dok je svjetlost koju emituju tačke izvan žarišne ravni defokusirana na izlaznu pinhole ravan, a većina njih ne može proći kroz centralnu pinhole. Zbog toga, ciljna tačka posmatranja na fokalnoj ravni izgleda svetla, a tačka koja se ne posmatra kao pozadina, povećava kontrast i čisti sliku. Tokom procesa snimanja, dve rupice su konfokalne, konfokalna tačka je detektovana tačka, a ravan u kojoj se detektovana tačka nalazi je konfokalna ravan.
Veličina otvora na detektoru u konfokalnoj mikroskopiji igra ključnu ulogu. On direktno utiče na rezoluciju i odnos signal/šum sistema. Ako je rupica prevelika, neće se postići efekat konfokalne detekcije, što ne samo da smanjuje rezoluciju sistema, već i uvodi više rasute svjetlosti; ako je rupica premala, to će smanjiti efikasnost detekcije i smanjiti mikroskopsku sliku. osvetljenost. Studije su pokazale da kada je promjer rupice jednak promjeru Airy diska, konfokalni zahtjevi su ispunjeni, a efikasnost detekcije nije značajno smanjena. Budući da je promjer rupice općenito reda mikrona, ako postoji odstupanje između fokusne točke laserskog zraka i položaja rupice, doći će do izobličenja signala. Stoga, konfokalni mikroskopi uglavnom koriste sistem autofokusa, koji praktično povećava vrijeme mjerenja.
S obzirom da je laserski konfokalni skenirajući mikroskop točkasta slika, da bi se dobila dvodimenzionalna slika objekta, potrebno je koristiti dvodimenzionalno skeniranje u x i y smjeru. Različiti mikroskopi koriste različite metode skeniranja:
(1) Skeniranje objekata. Odnosno, sam objekt se kreće prema određenom zakonu, dok svjetlosni snop ostaje nepromijenjen. Prednosti: stabilna optička putanja; Nedostaci: potreban je veliki stol za skeniranje, tako da je brzina skeniranja jako ograničena.
(2) Sistem za skeniranje zraka formira se korištenjem reflektivnog galvanometra. Odnosno, kontrolom galvanometra za skeniranje, fokusirana svjetlosna mrlja se redovno reflektuje na određeni sloj objekta kako bi se završilo dvodimenzionalno skeniranje. Njegova prednost je u tome što ima visoku preciznost i često se koristi za mjerenje visoke preciznosti. Brzina skeniranja je poboljšana u odnosu na skeniranje objekata, ali još uvijek nije brzo.
(3) Za skeniranje koristite akusto-optički otklonski element, a skeniranje se ostvaruje promjenom izlazne frekvencije zvučnog vala, a zatim promjenom smjera prijenosa svjetlosnog vala. Njegova izuzetna prednost je što je brzina skeniranja vrlo velika. Sistem za skeniranje koji su razvile Sjedinjene Države koristi akusto-optički deflektor za generiranje video slika u realnom vremenu. Za skeniranje dvodimenzionalne slike potrebno je samo 1/30 s, a gotovo postiže izlaz u realnom vremenu.
(4) Nipkow skeniranje diska. Proces skeniranja se završava rotacijom Nipkow diska dok ostale komponente ostaju mirne. Može se snimiti odjednom i brzina je vrlo velika. Međutim, budući da je snop slike izvan osi svjetlosti, aberacija sočiva van ose mora biti ispravljena, a stopa korištenja svjetlosne energije je vrlo niska.
