Tehnike bojenja i mikroskopsko promatranje mikroorganizama
Jednostavno bojenje bakterija
1 Ciljevi
1.1 Naučiti osnovne tehnike mikrobnog razmaza i bojenja.
1.2 Savladati jednostavnu metodu bojenja bakterija.
1.3 Upoznati morfološke karakteristike bakterija i konsolidirati učenje upotrebe uljnog ogledala i aseptičkih tehnika rada.
2 Princip Razmaz i bojenje bakterija je osnovna tehnika u mikrobiološkim eksperimentima. Ćelije bakterija su male i prozirne, nije ih lako prepoznati pod običnim svjetlosnim mikroskopom i moraju biti obojene. Upotreba jedne boje za bojenje bakterija, tako da obojeni organizam i pozadina formiraju jasnu razliku u boji, tako da se njihova morfologija i struktura mogu jasnije uočiti. Ova metoda je jednostavna za izvođenje i pogodna je za promatranje općeg oblika organizma i rasporeda bakterija. Alkalne boje se obično koriste za jednostavno bojenje, jer su u neutralnim, alkalnim ili slabo kiselim otopinama bakterijske stanice obično negativno nabijene, a kada su alkalne boje ionizirane, dio za bojenje njihovih molekula je pozitivno nabijen, tako da dio za bojenje alkalnih boja može se lako vezati za bakterije i učiniti ih obojenim. Obojene bakterijske ćelije u oštrom kontrastu s pozadinom i lakše ih je prepoznati pod mikroskopom. Uobičajene boje za jednostavno bojenje uključuju merocianin plavu, kristalno ljubičastu i bazičnu crvenu boju. Kada bakterijska razgradnja šećera proizvodi kiselinu tako da se pH medija smanjuje, povećava se pozitivni naboj bakterija, a zatim se može koristiti u crvenoj, kiseloj crvenoj ili kongo crvenoj i drugim kiselim bojama. Bakterije se moraju fiksirati prije bojenja. Njegova svrha je dvostruka: jedna je da ubije bakterije i učini da se bakterije zalijepe za stakalce; drugi je da se poveća njegov afinitet prema boji. Obično se koriste dvije metode: zagrijavanje i kemijska fiksacija. Pokušajte zadržati originalnu morfologiju stanica prilikom fiksiranja.
3 Materijali
3.1 Soj Bacillus subtilis 12-18h hranljiva agar kultura, Staphylococcus aureus oko 24h hranljiva agar kultura, Escherichia coli 24h hranljiva agar kultura, kosa agar agar pekarskog kvasca.
3.2 Boja Lue-ova alkalna metilen plava boja (ili kristalno ljubičasta boja amonijum oksalata), crvena boja jedinjenja karbonske kiseline.
3.3 Instrumenti ili drugi pribor Mikroskop, alkoholna lampa, stakalce, inokulacioni prsten, držač stakalca, dvoslojna boca (napunjena kedrovim uljem i ksilenom), papir za mikroskop, fiziološki rastvor ili destilovana voda, itd.
4 Procedura Razmazivanje → sušenje → fiksacija → bojenje → pranje → sušenje → mikroskopski pregled.
5 koraka
5.1 Razmaz Uzmite dva čista stakalca bez ulja, svako sa malom kapi fiziološkog rastvora (ili destilovane vode) u sredini stakalca u aseptičnim uslovima, sa inokulacionim prstenom za aseptički rad, od Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus i Escherichia coli nagnuti da se u kapi vode ubere malo mahovine, pomiješa se i premaže filmom. Ako se bakterijska suspenzija (ili tečna kultura) razmaže, može se koristiti za inokulaciju 2 do 3 prstena prstenastih prstenova direktno na stakalcu. Imajte na umu da fiziološke otopine (destilirana voda) i uzimanje bakterija ne smije biti previše i ravnomjerno se rasporediti, ne previše gusto.
5.2 Sušenje Osušite prirodno na sobnoj temperaturi. Može se sušiti i lagano zagrijavanjem iznad alkoholne lampe sa premazanom stranom prema gore. Međutim, nemojte se previše približavati plamenu, jer će previsoka temperatura uništiti morfologiju bakterija.
5.3 Fiksiranje Ako se koristi toplotno sušenje, fiksacija i sušenje se kombinuju u jednom koraku na isti način kao i sušenje. Razmazati, osušiti i zagrijati.
5.4 Bojenje Stavite stakalcu ravno na policu za stakalce, dodajte 1 do 2 kapi rastvora za bojenje na razmaz (prikladan je rastvor za bojenje koji samo pokriva film za razmazivanje). Bojite razmaz Lü's Basic Mellanox Blue 1~2 minute i karbonat crvenom (ili amonijum oksalat kristalno ljubičastom) oko 1 min.
5.5 Ispiranje Odlijte otopinu za bojenje i nježno isperite vodom iz slavine sa jednog kraja stakalca sve dok voda koja teče iz razmaza ne postane bezbojna. Prilikom ispiranja ne puštajte vodu da teče direktno kako biste oprali obloženu površinu. Protok vode ne smije biti prebrz ili prevelik kako bi se izbjeglo pomicanje razmazanog filma.
5.6 Sušenje Otresite kapljice vode na stakalcu da se prirodno osuši, fen ili upijajući papir se može koristiti za upijanje suhog (pazite da ne obrišete tijelo bakterije). 5.7 Mikroskopski pregled Razmaz se osuši i pregleda mikroskopski. Razmaz mora biti potpuno suh prije nego što se može promatrati uljnim mikroskopom.
6 Rezultati Nacrtajte morfologiju E. coli i Micrococcus garciniae nakon jednog bojenja.
Gram Stain
1 Svrha
1.1 Razumjeti princip bojenja po Gramu i njegovu važnost u klasifikaciji i identifikaciji bakterija.
1.2 Naučiti i savladati tehniku bojenja po Gramu i konsolidirati učenje upotrebe uljnog sočiva svjetlosnog mikroskopa.
