Razlika između pozitivnog i negativnog faznog kontrasta u mikroskopu
U zavisnosti od konfiguracije i prirode faznog prstena koji se nalazi na zadnjoj fokalnoj ravni objektiva, uzorci se mogu posmatrati u pozitivnom ili negativnom faznom kontrastu. Ovaj interaktivni tutorijal proučava odnos između okružujućeg (S), difrakcije (D) i rezultirajućih svijetlih čestica (P talasi), kao i mikroskopije pozitivnog i negativnog faznog kontrasta. Pored toga, prikazana je i geometrija fazne ploče i reprezentativni uzorci.
Kada ga ljudi sada koriste u svom radu, većina istraživača je u negativnoj razlici, a sada pozitivna razlika ne igra veliku ulogu u trenutnom naučnoistraživačkom radu.
Vodič inicijalizira faznu sliku sa nasumično odabranim uzorkom koji se pojavljuje u prozoru Phase Contrast Image, a odgovarajući odnos valova je prikazan u lijevom susjedu prozora slike. Da biste koristili tutorijal, koristite kursor miša za pomicanje prijevoda između pozitivnog i negativnog faznog kontrasta ili klizača za režim faznog kontrasta jakog osvjetljenja. Kada se klizač prevede, slike koje se pojavljuju u prozoru slike faznog kontrasta mijenjaju način na koji se uzorak pojavljuje u trenutnom režimu snimanja koji je postavljen klizačem. Također, ispod grafikona valnog oblika nalazi se fazna ploča koja mijenja oblik kako bi odgovarala načinu snimanja odabranom klizačem. Da biste vidjeli novi uzorak, koristite padajući izbornik Selected Sample da odaberete drugi uzorak.
Grafikon konfiguracije fazne ploče, valnih odnosa i vektora povezanih s generiranjem pozitivnih i negativnih slika faznog kontrasta prikazan je na slici 1. Prikazani su i primjeri uzoraka snimljenih ovim tehnikama. U optičkoj konfiguraciji s pozitivnim faznim kontrastom (gornji red slike na slici 1), surround (S) talasni front prolazi kroz faznu ploču, što rezultira neto faznim pomakom od 180 stepeni napredovanja faze, za 1/4 talasne dužine ( 1 pola talasne dužine). Napredni surround talasni frontovi su sada u stanju da učestvuju u destruktivnoj interferenciji sa difraktiranim (D) talasima u srednjoj ravni slike. U većini slučajeva, samo napredovanje relativne faze okolnog talasnog fronta nije dovoljno da dovede do stvaranja slika visokog kontrasta u Nikon mikroskopima. To je zato što je amplituda okružujućih valova znatno veća od amplituda difrakiranih valova i potiskuje rezultujuću sliku proizvedenu interferencijom od dijela ukupnog broja valova. Da bi se okolni talasni front sveo na vrijednost bližu amplitudi difrakiranih valova (i radi interferencije u ravnini slike), neprozirnost u faznom prstenu objektiva se postiže primjenom poluprozirnog metala (neutralna rastuća gustina ) premaz Pod. Okolni svjetlosni valovi, koji projektirano gotovo u potpunosti prolaze kroz fazni prsten, pod faznokontrastnom mikroskopijom, značajno su smanjeni u amplitudi zbog neprozirnosti fazne ploče na vrijednost u rasponu od 10 do 30 posto prvobitnog intenziteta.
Budući da je rezultirajući val čestica proizveden interferencijom* okolnih i difrakiranih valnih frontova, amplituda čestičnog (P) vala proizvedenog interferencijom između valnih frontova koji dolaze do ravni slike sada je mnogo manja od okolne kada je u seksualnom nanesen sloj gustine. Neto efekat je pretvaranje relativne fazne razlike uvedene prolaskom svjetlosti koja izlazi iz ravni slike kroz uzorak u razliku u amplitudi (intenzitetu). Budući da će ljudsko oko tumačiti razliku u intenzitetu kao kontrast, uzorak je sada vidljiv u okularu mikroskopa i može se snimiti na membranu konvencionalnim sistemima kamera, ili digitalno, koristeći CCD ili CMOS uređaje. Svi pozitivni fazni kontrastni sistemi selektivno unapredjuju fazu linearnog surround (S) talasnog fronta u odnosu na sferni difraktovani (D) talasni front. Uzorci s većim indeksom loma od okolnog medija izgledaju tamniji na neutralno sivoj pozadini, dok oni s nižim indeksom loma od medija za plivanje izgledaju svjetlije od sive pozadine.
Da bi se modificiralo prostorno odvajanje difraktovanih talasnih frontova koji okružuju fazu i amplitudu u optičkom sistemu faznog kontrasta, uveden je niz konfiguracija faznih ploča. Budući da se fazna ploča nalazi na stražnjoj fokalnoj ravni (difrakcijska ravan) ili vrlo blizu nje, sva svjetlost koja prolazi kroz mikroskop mora proći kroz ovu komponentu. Dio fazne ploče u njenom prstenastom fokusu kondenzatora naziva se konjugirana regija, dok se preostali dio naziva komplementarna regija. Konjugirana regija sadrži materijal koji je odgovoran za promjenu faze okolnog (nedifraktiranog) svjetla za plus ili minus 90 stepeni u odnosu na difrakirani talasni front. Općenito, područje fazno konjugiranog prstena je šire (oko 25 posto) od područja definiranog kondenzacijskom slikom prstena kako bi se smanjila količina okolne svjetlosti koja se širi na komplementarnu oblast.
Većina faznih ploča dostupnih od modernih proizvođača mikroskopa su one koje se pripremaju vakuumskim taloženjem tankih dielektričnih i metalnih filmova na staklenu ploču ili se montiraju direktno na površinu sočiva objektiva mikroskopa. Uloga dielektričnog filma je faziranje svjetlosti, dok metalni film umanjuje intenzitet nedifragirane svjetlosti. Neki proizvođači koriste više antirefleksnih premaza u kombinaciji sa folijom kako bi smanjili količinu odsjaja i refleksije rasute svjetlosti natrag u optički sistem. Ako se fazna ploča ne formira na površini sočiva, obično je cementirana između uzastopnih sočiva koje se nalaze na fokalnoj ravni blizu stražnjeg dijela objektiva. Debljina i indeks prelamanja dielektričnih, metalnih i antirefleksnih premaza, kao i optičkog cementa, pažljivo su odabrani kako bi se proizveo željeni fazni pomak između komplementarnih i konjugiranih područja fazne ploče. U optičkim terminima, fazna ploča koja mijenja fazu u odnosu na okolno svjetlo da bi odvojila svjetlost za 90 stupnjeva (bilo pozitivno ili negativno) naziva se četvrtvalnom pločom zbog efekta optičke razlike putanje na nju.
Pregled inverzne pozitivne faze prikazan je na slici 1. Kontrastna ploča pozitivne faze (lijeva strana slike 1) pokreće okružujući val, za 1/4 valne dužine, zbog erozionog prstena u staklenoj ploči, koji može biti smanjen gornjim prolazom u ploči visokog indeksa. Preuzeta fizička putanja vala. Zbog interakcije sa uzorkom, kada su difraktirani zraci uzorka (D) retardirani, razlika optičke putanje između okružujućih i difraktiranih talasa koji izlaze iz fazne ploče je pola talasne dužine sa 1/4 talasne dužine. Konačni rezultat je 180-stepena razlika optičke putanje između okolnih i difrakiranih talasa, što rezultira destruktivnom interferencijom za uzorke visokog indeksa prelamanja između ravni slike. Krivulja amplitude za pozitivni fazni suprotni destruktivni interferentni talas prikazana je na gornjem grafikonu na slici 1. Rezultirajući talas čestica (P) ima nižu amplitudu od okružujućeg (S) talasa, zbog čega se objekat čini u poređenju sa relativno tamnija pozadina. Dole, slika zelene alge Zygnema prikazana na desnoj strani (označena DL). Vektor predstavljen napretkom 1/4 talasne dužine, koji je prikazan kao 90-stepeni rotirajući surround talas u smeru suprotnom od kazaljke na satu u pozitivnom faznom kontrastu, pojavljuje se između slike i slike na slici 1.
Alternativno, optika mikroskopa se također može izraditi tako da proizvede negativnu fazu suprotnu, kao što je prikazano u donjem dijelu slike 1, u kom slučaju su okružujući (S)-talasi odgođeni (a ne napredni) za četvrtinu talasne dužine u odnosu na jedan difraktirani (D) talas. Kao rezultat toga, uzorci s visokim indeksom prelamanja izgledaju svjetlije na tamnijoj sivoj pozadini (pogledajte donju sliku označenu BM na slici 1). U suprotnoj negativnoj fazi, objektivna fazna ploča sadrži podignuti prsten koji usporava fazu (umjesto da napreduje kao pozitivna faza nasuprot), prolazeći četvrtinu valne dužine u odnosu na fazu difraktiranog vala kao okružujući val nultog reda. Budući da su difrakcijski valovi odgođeni za četvrtinu valne dužine dok prolaze kroz uzorak, razlika optičke putanje između okolnih i difrakiranih valova je eliminisana i uzorak s visokim indeksom prelamanja konstruktivno interferira u ravni slike. Imajte na umu da je rezultujuća čestica (P) amplitude veća od surround (S) talasa u negativnom faznom kontrastu. Takođe je prikazana negativna faza obrnutog kretanja, gde vektor talasa oko plovidbe prolazi kroz rotaciju vektorskog dijagrama za 90 stepeni u smeru kazaljke na satu.
