Glavna metoda posmatranja optičkog mikroskopa je posmatranje fluorescencije
Fluorescencija se odnosi na proces u kojem fluorescentna supstanca emituje svetlost veće talasne dužine skoro istovremeno kada je ozračena svetlošću određene talasne dužine (slika 1). Kada svetlost određene talasne dužine (valne dužine ekscitacije) udari u molekul, poput onih u fluoroforu, energiju fotona apsorbuju elektroni molekula. Zatim, elektroni prelaze iz osnovnog stanja (S0) u viši energetski nivo, pobuđeno stanje (S1'). Ovaj proces se naziva ekscitacija①. Elektron ostaje u pobuđenom stanju 10-9–10-8 sekundi, tokom kojih elektron gubi nešto energije②. Tokom procesa napuštanja elektrona iz pobuđenog stanja (S1) i vraćanja u osnovno stanje③, oslobađa se preostala energija apsorbovana tokom procesa ekscitacije.
Vreme boravka fluorescentnog molekula u pobuđenom stanju je životni vek fluorescencije, koji je generalno na nivou nanosekunde, i inherentna je karakteristika samog fluorescentnog molekula. Fluorescentna doživotna slika (FLIM), koja koristi tehnologiju fluorescentne doživotne slike, naziva se fluorescentna doživotna slika (FLIM). Pored snimanja intenziteta fluorescencije, mogu se dobiti dublja funkcionalna i preciznija mjerenja kako bi se dobila molekularna konformacija, međumolekularne interakcije i mikrookruženje molekula. Informacije koje je teško dobiti konvencionalnim optičkim slikama.
Još jedno važno svojstvo fluorescencije je Stokesov pomak, razlika u talasnoj dužini između ekscitacije i emisionog vrha (slika 2). Obično je talasna dužina emisije duža od talasne dužine ekscitacije. To je zato što će elektroni izgubiti dio svoje energije kroz proces relaksacije nakon što je fluorescentna supstanca uzbuđena i prije otpuštanja fotona. Fluorescentne supstance sa većim Stokesovim pomacima lakše je posmatrati pod fluorescentnim mikroskopom.
Fluorescentna mikroskopija i fluorescentne filter kocke
Fluorescencijski mikroskop je optički mikroskop koji koristi svojstva fluorescencije za posmatranje i snimanje, i široko se koristi u različitim poljima kao što su ćelijska biologija, neurobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija i genetika. Fluorescentno snimanje ima prednosti visoke osjetljivosti i visoke specifičnosti, te je vrlo pogodno za promatranje distribucije specifičnih proteina i organela u tkivima i stanicama, proučavanje kolokalizacije i interakcije, praćenje životnih dinamičkih procesa kao što su promjene koncentracije jona. , itd.
Većina molekula u ćelijama ne fluorescira, a da bi ih vidjeli moraju biti fluorescentno označeni. Postoje mnoge metode fluorescentnog obilježavanja, kao što je direktno označavanje (kao što je korištenje DAPI-a za obilježavanje DNK), ili imunološko bojenje korištenjem svojstava antitela koji vežu antigen, ili korištenje fluorescentnih proteina (kao što je GFP, zeleni fluorescentni protein) za obilježavanje ciljnih proteina , i reverzibilno vezivanje. Sintetičke boje (kao što je Fura-2) i tako dalje.
Trenutno je fluorescentni mikroskop postao standardna oprema za snimanje različitih laboratorija i platformi za snimanje i dobar je pomoćnik za naše svakodnevne eksperimente. Fluorescentni mikroskopi se uglavnom dijele u tri kategorije: uspravni fluorescentni mikroskopi (prikladni za rezanje), inverzni fluorescentni mikroskopi (prikladni za žive ćelije, uzimajući u obzir rezanje), fluorescentni stereoskopi (prikladni za veće uzorke, kao što su biljke, zebrice (odrasli/embrioni) ) , medaka, organi miša/pacova itd.).
Fluorescentni filterski blok je osnovna komponenta fluorescentnog snimanja mikroskopom. Sastoji se od tri dijela: ekscitacioni filter, emisioni filter i dikroični razdjelnik zraka. Ugrađuje se u točak filtera. Na primjer, Leica DMi8 je opremljen 6-točkom za filter položaja (slika 3). Broj položaja različitih kotačića mikroskopa će biti različit, a neki mikroskopi koriste klizače filterskih blokova.
Blok filtera igra važnu ulogu u fluorescentnom snimanju: ekscitacioni filter bira ekscitaciono svetlo da pobuđuje uzorak i blokira svetlost drugih talasnih dužina; svjetlost koja prolazi kroz ekscitacijski filter prolazi kroz dihroično zrcalo (njegova funkcija je da reflektuje pobuđujuću svjetlost i prenosi fluorescenciju), nakon refleksije, fokusira se sočivom objektiva, zrači uzorak i pobuđuje odgovarajuću fluorescenciju, tj. , emituje svetlost. Emitovano svjetlo prikuplja objektiv objektiva, prolazi kroz dikroični razdjelnik zraka i dolazi do emisionog filtera. Kao što je prikazano na slici 4: talasna dužina pobude je 450-490nm, dikroično ogledalo reflektuje svjetlost kraću od 510nm, prenosi svjetlost dužu od 510nm, a opseg prijema emitovane svjetlosti je 520-560nm.
