Postoje dvije vrste fluorescentnih mikroskopa u smislu njihove optičke putanje
1. Transmisioni fluorescentni mikroskop: Ekscitacijski izvor svjetlosti prolazi kroz materijal uzorka kroz kondenzatorsko sočivo da pobuđuje fluorescenciju. Obično se koristi kolektor tamnog polja, a obični kolektor se također može koristiti za podešavanje ogledala tako da se pobudna svjetlost preusmjeri i zaobiđe na uzorak. Ovo je stariji fluorescentni mikroskop. Prednost je što je fluorescencija jaka pri malom uvećanju, ali nedostatak je što fluorescencija opada sa povećanjem povećanja. Stoga je bolje promatrati veće materijale uzoraka.
2. Epifluorescentni mikroskop je nova vrsta fluorescentnog mikroskopa razvijena u moderno doba. Razlika je u tome što ekscitacijsko svjetlo pada sa sočiva objektiva na površinu uzorka, odnosno, isto sočivo objektiva se koristi kao kondenzator osvjetljenja i objektiv objektiva za prikupljanje fluorescencije. Dihroični razdjelnik snopa treba dodati u putanju svjetlosti, koja je udaljena 45 stepeni od laganog uranijuma. Ekscitacijsko svjetlo se reflektira u objektiv objektiva i sakuplja na uzorku. Fluorescencija koju generira uzorak i pobuđujuća svjetlost reflektirana od površine sočiva objektiva i površine pokrovnog stakla ulaze u sočivo objektiva u isto vrijeme i vraćaju se na dvobojni razdjelnik zraka kako bi pobudno svjetlo bilo odvojeno od fluorescencije , preostala pobudna svjetlost se apsorbira blokirajućim filterima. Kao što je prelazak na kombinaciju različitih filtera uzbude/dvobojnog razdjelnika zraka/filtera za blokiranje, može zadovoljiti potrebe različitih fluorescentnih reakcijskih proizvoda. Prednost ove vrste fluorescentnog mikroskopa je u tome što je osvjetljenje vidnog polja ujednačeno, slika jasna, a što je veće povećanje, to je fluorescencija jača.
