Znanja vezana za fluorescentni mikroskop
Osnovni princip konfokalne fluorescentne mikroskopije: za ozračivanje uzorka koristi se tačkasti izvor svjetlosti, a na fokalnoj ravni se formira dobro definirana mala svjetlosna mrlja. sastavljena od razdjelnika. Razdjelnik zraka šalje fluorescenciju direktno na detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, odnosno rupica za osvjetljenje i rupica za detekciju. Geometrijska veličina oba je ista, oko 100-200nm; u odnosu na svetlosnu tačku na fokalnoj ravni, ova dva su konjugirana, to jest, svetlosna tačka prolazi kroz niz sočiva, i konačno može biti fokusirana na otvor za osvetljenje i otvor za detekciju u isto vreme. Na ovaj način, svjetlost iz žarišne ravni može se konvergirati u okviru otvora za detekciju, dok je raspršena svjetlost iznad ili ispod fokalne ravni blokirana izvan otvora za detekciju i ne može se snimiti. Laser skenira uzorak tačku po tačku, a fotomultiplikatorska cijev nakon detekcije rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke tačku po tačku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi na kompjuter, i na kraju agregira u jasnu konfokalna slika cijele fokalne ravni na ekranu.
Svaka slika u fokalnoj ravni je zapravo optički poprečni presek uzorka, a ovaj optički presek uvek ima određenu debljinu, poznatu i kao optički tanak presek. Budući da je intenzitet svjetlosti u žarišnoj tački mnogo veći od intenziteta u nefokusnoj tački, a svjetlost u nefokalnoj ravni filtrira rupica, dubina polja konfokalnog sistema je približno nula, a skeniranje duž Z -os može realizovati optičku tomografiju, formirajući Posmatrajte dvodimenzionalni optički presek na fokusiranoj tački uzorka. Kombinujući skeniranje u ravni XY (fokalna ravan) sa skeniranjem po Z-osi (optička osa), trodimenzionalna slika uzorka se može dobiti akumuliranjem dvodimenzionalnih slika kontinuiranih slojeva i obraditi posebnim kompjuterskim softverom.
To jest, rupica za detekciju i rupica izvora svjetlosti su uvijek fokusirani na istu tačku, tako da fluorescencija pobuđena izvan fokalne ravni ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserskog konfokalnog je da koristi lasersko svjetlo kao izvor svjetlosti. Na osnovu tradicionalnog fluorescentnog mikroskopskog snimanja, dodaje uređaj za lasersko skeniranje i konjugirani uređaj za fokusiranje, i predstavlja sistem za dobijanje i obradu digitalne slike putem kompjuterske kontrole.
